ФЕРМЕНТЫ ГРИБОВ

Питание и обмен веществ у живых организмов были бы невоз­можны без специфических органических катализаторов — фермен­тов, и в особенности это касается организмов гетеротрофов, кото­рые используют для своего питания сложные органические соеди­нения, находящиеся в окружающей их среде. Эти органические соединения очень часто, если не в большинстве случаев, представ­ляют собой нерастворимые в воде полимеры, которые необходимо при их использовании расщепить на отдельные молекулы — моно­меры. Для этого требуется широко развитая способность выделять в окружающую среду экзоферменты, приспособленные к находя­щемуся в ней субстрату. Другими словами, гетеротрофным орга­низмам необходимо обладать способностью изменять в зависимо­сти от условий среды качественный и количественный состав син­тезируемого ими комплекса ферментов.

Ферменты не распределены равномерно по всей клетке, а » большинстве случаев связаны с определенными ее структурами. Это показали уже самые первые опыты по суперцентрифугирова­нию клеточных гомогенатов. При этом нижний слой гомогената* содержащий митохондрии, показал в аппарате Варбурга поглоще­ние кислорода, измеряемое 2500 условными единицами, средний, слой, содержащий рибосомы — 60 единицами, а у не содержащего субклеточных структур верхнего слоя поглощение кислорода от­сутствовало полностью. Такой прозрачный цитоплазматический1 слой обычно содержит только гидролитические ферменты и боль­шую часть ферментов путей гликолиза, тогда как ферменты цикла Кребса, дыхательной цепи и большинство синтетаз содержатся в митохондриях, микросомах, рибосомах, мембранах и в ядрах кле­ток. Гидролитических ферментов может оказаться больше, чем » клетке, в окружающей среде, куда они интенсивно выделяются.

Однако чаще это происходит не сразу после их биосинтеза* сопровождающего рост продуцента. Первоначально они накапли­ваются в мицелии, как связанные в цитоплазматической мембране. Участвующие в их биосинтезе связки рибосом и соответствующая информационная РНК локализуются на внутренней стороне плаз­матической мембраны (рис. 6.1). Формируемый ими фермент ло­кализуется внутри нее и представляет собой в это время высоко­молекулярный фосфолипопротеин, содержащий одновременно ли — пофильную и гидрофильную с терминальной ЫН2-группой цепи* способствующие ее транспортировке через мембрану. Окончатель­но сформированный энзим попадает далее в периплазматические пузырьки — мезосомы, причем его молекулярная масса падает в ~20 раз, видимо, за счет потери транспортных устройств, отщеп­
ляемых эндопептидазами. Энзим принимает при этом форму энзи — матически активного глобулярного белка и транспортируется на наружную поверхность мембраны и в окружающую среду (Воте, 1981).

Я

ч’Л з I

Сложный процесс синтеза и транспорта таких энзимов, естест­венно, разобщает во времени сопровождающий рост общий био­синтез белков и выделение и накопление гидролаз в культуральной среде. Именно с этим связано наблюдаемое у грибов резкое раз­личие в длительности жизни информационной РНК, кодирующей биосинтез секреторных гидролаз, по сравнению с кодирующей внутриклеточные энзимы, что, вероятно, зависит от течения формирования секреторных энзимов в мембрано-связанном состоянии.

С£!- С£! С6

ъ

ъ’

И-РНК

О

Связанное с полимерами мембран состояние способст­вует сохранности стабильности не только кодирующей синтез ферментов информационной РНК, но и самих энзимов, что в последнее время широко ис­пользуется для их стабилиза­ции.

О

Рис. 6.1. Гипотетическая модель синтеза и секреции экзоэнзима. Сигнальный ко­дой ииформациоииой РНК обозначен как область зигзага, сигнальиаи после­довательность в начале нативного про­теина — как пунктирная линия. Напра­во — изменение конформации и выделе­ние через клеточную мембраиу в среду синтезированного энзима (Воте, 1981)

Среди ферментов различа­ют конститутивные, формирую­щиеся с самого начала онто­генеза, и адаптивные, появля­ющиеся впоследствии в зави­симости от условий окружаю­щей среды. В случае гидроли­тических адаптивных фермен­тов, расщепляющих высокомо­лекулярные субстраты (поли­сахариды, белки и т. п.), ин­дукторами их появления могут быть либо их субстраты, либо иногда мономерные продукты про­изводимых ими реакций. Последнее отмечалось для некоторых ферментов, гидролизующих полисахариды, например, индуктором некоторых пектиназ является галактуроновая кислота. Субстрат реакции нередко индуцирует также формирование ферментов, участвующих в детоксикации. Так, принадлежащий к эстеразам фермент трихотециназа начинает образовываться у почвенных грибов при наличии в среде субтоксических доз антибиотика три — хотецина.

Даже конститутивные энзимы, к которым относится большин­ство ферментов основного обмена, в онтогенезе грибов формиру­ются не сразу, а в определенной последовательности, и кроме того, набор их в зависимости от возраста культуры сильно меняется как

по количественным соотношениям, так и качественно. Это можно — видеть из целого ряда примеров, часть из которых уже приводи­лась при обсуждении путей гликолиза у грибов. Было установлено, что изменения в наборе дыхательных энзимов, включающих гексо — киназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, дегидрогеназы кислот цикла Кребса и ряд других, и в их активности наблюдают­ся уже при прорастании спор ряда плесневых грибов, как Tricho — derma viride, Aspergillus niger, Pйnicillium atrovenatum, P. oxali — cum. В процессе образования ростовых трубок активность ряда ферментов, особенно имеющих в качестве кофермента НАД, воз­растала в 51—200 раз.

Аналогичная картина наблюдалась при развитии у грибов ор­ганов плодоношения. При развитии шляпки плодовых тел Schizo — phyllum commune в ней значительно возрастала активность R-глю — каназы, расщепляющей содержащийся в оболочках его клеток по­лисахарид с одной-тремя связями мономеров глюкозы, R-глюкан. Особенно активизировался этот адаптивный энзим при недостатке в среде глюкозы (Wessels, 1966). Активность многих ферментов меняется не только на протяжении всего онтогенеза или его узло­вых этапов, но и при таких краткосрочных периодических процес­сах, как деление клеточных ядер. Так, у базидиомицета Clavatia cyatiformis в гифах, находящихся в состоянии мейоза (редукцион­ного деления), резко возрастала активность фосфатазы (Blumer, Li-Yu-Ten, 1966). Сильно изменялось также содержание окисли­тельных и других ферментов в процессе развития мицелия Pйnicil­lium chrysogenum при ферментации пенициллина (Маттисон, 1956) и концентрация амилазы в погруженной культуре Aspergillus ni­ger. Примеры подобного рода могут быть значительно расширены.

стие энзимы, переносящие неор­ганический фосфат (ацилирую — щие), осуществляющие дальней­шее перемещение фосфата на АДФ, киназы, фосфотрансферазы, переносящие фосфорные группы с одного углевода на другой или с одного атома углерода на дру­гой. В этапе использования энер­гии фосфорных связей на синтезы участвуют фосфатазы, отщепля­ющие неорганический ортофосфат или пирофосфат, а субстратом для этого процесса могут служить как нуклеотиды (например, АТФ), так и обильные у грибов полифосфаты (см. вторую главу). Как при использовании до­нора энергии АТФ, так и поли­фосфатов, запасание и расходо­вание энергии фосфорных связей распадается на два этапа: обра­зование этих связей и их расщеп­ление. Первый этап осуществляется с помощью ацилирующих энзимов, содержащих ЭН-группы (в частности, в форме КоА). В качестве кофермента фосфогексокиназы, переносящей фосфор цри фосфорилировании моносахаров, известен рибофлавин. Вто- Сукцинил-КоА + АДФ + Фнеорг + НаО Т Сукцинаттиокиназа Янтарная кислота + КоА + АТФ Рис. 6.3. Фосфорилирование АДФ в цикле Креб­са (Девис и др., 1966)

бБН

/ /

ЫАД >-НАД — г о Комплекс-ферментНАД 11 / Р-С-Н (3-фосфоглицеринорыи О

/ / I {НАДН.

Я в-ь-с- 4т

альдегид-субстрат] (Ацилфермент)

б-Б-С-Р — ОН

(1 3-дифосфоглщери — новая кислота)

Ф-О-С-Р |^АД1> ^ 3-фасфоглицераткшаза IУ (3-фосфоглицериноВоя ‘-г-а * кислота)

но-с-и

Рис. 6.2. Механизм фосфорилирова — ния, сопряженный с окислением фос- фоглицерииового альдегида в 1,3-фос — фоглицериновую кислоту: Е — энзим (дегидрогеназа); Ф — фосфат (Де­вис и др., 1966)

3-фосфоглицеринового альдегида в 1,3-дифосфоглицериновую кис­лоту, макроэргический фосфат которой переносится затем, при трансформации ее в 3-фосфоглицериновую кислоту, на АДФ, трансформирующийся при этом в АТФ (рис. 6.2). Аналогичный процесс протекает в пределах цикла трикарбоновых кислот, на­пример, при образовании сукцинил коэнзима А и трансформации его в янтарную кислоту (рис. 6.3). Помимо ферментов, относящихся к НАД и флавиндегидроге — назам, обеспечивающих этап получения энергии путем окисления» в этих процессах принимают уча-

рой этап — расщепление фосфорных связей с образованием ор­тофосфата — осуществляется фосфатазами, которые в связи с их использованием для аналитических целей изучались довольно подробно.

Эти ферменты применяются, в частности, для отщепления фос­фата от тиаминпирофосфата при анализе тиамина и расщеплении фосфорилированного НАД при анализе витамина PP. Фосфатазы относятся к эстеразам, гидролизующим эфиры фосфорной кисло­ты. Сюда относят ферменты, гидролизующие эфиры фосфорной кислоты с углеводами, глицерофосфатазу, апиразу, расщепляю­щую АТФ, пирофосфатазу, метафосфатазу и другие полифосфата — зы. У грибов полифосфатаза впервые была найдена Манном у Aspergillus niger.

В дальнейшем, при изучении этого типа энзимов у Pйnicillium chrysogenum, были найдены апираза, расщепляющая АТФ, пиро — фосфатаза и метафосфатаза, которые все подавлялись ионами кальция, цинка и магния при pH от 3,0 до 5,0, а также фторидами и азидом. Глицерофосфатаза P. chrysogenum изучалась Садасива — ном, который обнаружил, что их имеется две (Sadasivan, 1965): щелочная с оптимальным pH от 8,0 до 9,0, содержащая магний и цинк, и кислая с оптимумом действия в кислом диапазоне pH. Щелочная фосфатаза сильно угнеталась синильной кислотой и кальцием и реактивировалась магнием и цинком, кислая реагиро­вала на синильную кислоту значительно слабее.

У некоторых плесневых грибов, а именно у Pйnicillium lilaci — пит, Aspergillus oryzae, A. niger и Rhizoctonia violacea, фосфатаза образовывалась и даже стимулировалась при недостатке магния в среде. Однако при введении в среду возможного конкурента магния — бериллия — у испытанных видов рода Aspergillus на­блюдалось подавление синтеза этого фермента, хотя у других двух видов — P. lilacinum и R. violacea — на первых стадиях развития его активность усиливалась.

Фосфатазы проявляют высокую активность в процессе деления клеток, что было отмечено как для процессов редукционного деле­ния на примере базидиомицета Clavatia cyatiformis (Blumer, Li — Yu-Ten, 1966), так и для обычного кариокинеза у целого ряда па­разитных и сапротрофных грибов.

При рассмотрении фосфорного обмена у высших эукариот, рас­тений и животных основное внимание уделяется реакциям, в кото­рых принимает участие как донор фосфора и энергии аденозинтри — фосфат. Однако низшие эукариоты (грибы, водоросли, протисты) и прокариоты (бактерии, актиномицеты и цианобактерии) имеют и другие, видимо, еще более значимые для их метаболизма, чем АТФ, доноры фосфора и энергии, а именно пирофосфат и неорга­нические высокополимерные полифосфаты. Поэтому ферменты гри­бов, имеющие отношение к их обмену, заслуживают специального рассмотрения (Кулаев, 1975).

Такие ферменты делятся на две категории: 1) имеющие отно­шение к их биосинтезу и 2) функционирующие при их использо­вании на нужды обмена веществ. Известны два фермента, произ­водящие наращивание цепи полифосфатов на один фрагмент, а именно полифосфаткиназа и 1,3-дифосфоглицерат-полифосфат- трансфераза (ДФГК/рис. 6.4). Полифосфаткиназа наращивает по — лифосфатную цепь на один фрагмент за счет трансформации АТФ в АДФ. Однако направление действия полифосфаткиназы в сторо­ну синтеза полифосфата известно только у бактерий, тогда как грибы (Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae) способны толь­ко к необратимой реакции переброса фосфорной группы с поли­фосфата на АДФ, т. е. насыщению фосфором пула АДФ-*-АТФ. У ряда грибов (Neurospora crassa, Pйnicillium chrysogenum) не было обнаружено даже в этой реакции. Напротив, у всех иссле-

1. Полифосфаткнназа:

У бактерий АТФ + ПФ„ -» АДФ + ПФП+,

У бактерий и грибов

2. 1,3-дифосфоглицерат-полифосфаттраксфераза (ДФГ-ПФТ)г

СОО ~ (Р) У грибов и СООН

TOC o "1-5" h z | бактерий |

СНОН + ПФ„ , СНОН 4- ПФ„+1

I I

СНгО —(Р) СНгО —(Р)

Рис. 6.4. Реакции полифосфат-синтезирующих фрементов у бактерий и грибов (Кулаев, 1975)

дованных бактерий она существовала и была обратимой, хотя и здесь, судя по максимальному развитию этой активности в конце онтогенеза бактерий, его основная роль приурочена к моменту максимального расхода полифосфатов и обогащения пула АТФ (Кулаев, 1975).

Второй фермент, 1,3-дифосфоглицератполифосфаттрансфераза (ДФГ-ПФК), наращивающий полифосфатную цепь за счет перено­са фосфата с 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, был найден пер­воначально у аденин-дефицитного мутанта Neurospora crassa, но затем и у дикого штамма этого гриба, у Pйnicillium chrysogenum и у ряда бактерий и актиномицетов. При наличии альдолазы суб­стратом действия этого фермента может служить также и 1,6- фруктозодифосфат. Он ингибируется известными ингибиторами гликолиза по пути ЭМП как монойодуксусная кислота или смесь фторида и арсенита, что говорит о тесной связи этого пути биосин­теза полифосфатов с циклом ЭМП. О том же говорят данные ци­тохимических исследований онтогенеза грибов, подтверждающие связь у них синтеза полифосфатов с этим путем обмена (Дмитрие­ва, Беккер и др., 1962). Судя по максимальной активности этого фермента в период наиболее интенсивного наращивания пула по­лифосфатов, именно он, а не полифосфаткиназа является наиболее вероятным агентом биосинтеза полифосфатов.

На основе первых изотопных исследований предположили, что различные фракции полифосфатов образуются за счет деградации полифосфатдеполимеразами первично синтезированных наиболее высокомолекулярных фракций, что, в общем, соответствует истине, хотя, возможно, объясняется локализацией этих деполимераз в зоне действия синтезирующих полифосфаты ферментов в области клеточной мембраны и зоны поступления из среды ортофосфата. Однако позднее было обнаружено, что эти фракции могут синте­зироваться и независимо друг от друга. Например, у базидиоми — цета Lert/trtыs Ицпаиэ и аскомицета кеигоБрога сгаББа была обна­ружена корреляция накопления солерастворимой фракции поли­фосфатов (ПФ2) с биосинтезом РНК и ДНК на уровне коэффи­циента корреляции, равном 0,88. Подтверждение объяснения этого явления было получено при исследовании на БсЫгозассНаготусез ротЬе.

Максимум активности предположительно участвующей в снаб­жении энергией биосинтеза полифосфатов пирофосфатазы опере­жает максимум накопления нуклеиновых кислот и ПФ2 фракции

Рис. 6.5. Динамика изменения содержания нуклеиновых кислот, полифосфатов, полифосфатфосфогидролазы (ПФаза) и пирофосфатазы (ПироФаза) у БсЫго — засскаготусез pom. be. ПФ1 и ПФа, — кислоторастворимые и солерастворимые полифосфаты; ПФ3> ПФ4 и 2ПолиФ — щелочерастворимые, растворимые в го­рячей хлорной кислоте и сумма всех полифосфатов (Кулаев, 1975) 120 ISO WO 210 MUH

(рис. 6.5). Предположительная схема этого процесса приводится на рис. 6.6.

Сходный механизм с участием той же пирофосфатазы предпо­ложительно объясняет корреляцию накопления фракции полифос­фатов ПФ3 с синтезом маннана, компонента оболочки дрожжей Saccharomyces carlsbergietisis (рис. 6.7).

Необходимы ли для синтеза полифосфатов какие-либо матрич­ные основы или затравки пока неясно, но есть данные, что для него требуются затравки в форме три-, тетра — и других полифос­фатов. Существенно, что вторичный синтез полифосфатов действи-

РНК (ДНИ) полимераза

АТФ

РНК(ДНК)

ГТФ

ЦТФ

УТФ (ТТФ)

(п) Пиросроссрат Полафосфат (т)

Пиросросфатаза (?)]

(п-1) Пирофосфат * Ортофосфат Полифосфат (т*1)

Рис. 6.6. Схема сопряженного синтеза полифосфатов и биосинтеза РНК и ДНК

(Кулаев, 1975)

тельно имеет место у грибов, локализуясь в местах усиленного биосинтеза (клеточная мембрана, ядро) с использованием энергии и ортофосфата от расщепления освобождающегося при этих био­синтезах пирофосфата.

Низкополимерные пирофосфаты могут образовываться путем следующих реакций, характер которых показан в табл. 6.1. При

ГТФ

Пиросросфат Рис. 6.7. Схема, объясняющая корреля­цию накопления полифосфатов у Saccha­romyces carlsbergiensis (Кулаев, 1975)

этом триполифосфаты могут ■быть продуктом действия де­полимераз, синтезироваться из пирофосфата и фрагмента фос­форной кислоты, отщепляемого от АТФ, быть продуктом от­щепления трехфрагментного остатка фосфатов от нуклеозид трифосфата, получаться при образовании из АТФ и метио­нина Э-аденозилметионина и, наконец, образовываться в про­цессе биосинтеза витамина В12. Для биосинтеза тетраполифос­фата (см. табл. 6.1) известна реакция, основанная на раз­рыве циклической структуры

Способы образования триполифосфатов и тетраполифосфатов (Кулаев, 1975)

Образование триполифосфатов:

1. ПФ„——————————————————— »-3-ПФ+ПФ„_3.

2. Пирофосфат+АТФ у "З-ПФ+АДФ.

3. Нуклеозидпирофосфат —————————————- *-нуклеозид+ 3-ПФ.

4. АТФ+метионин ^-аденозилметионин+З-ПФ.

восстановленный флавин

5. АТФ + цианкобаламин, ’5-прлокг. иапр. но.'{илкобалямин4-

+ СЫ — + 3-ПФ.

Образование тетраполифосфата:

Триметафосфат (циклический) + ортофосфат———————————————————- М-ПФ.

триметафосфата с включением в полученную цепь одного фраг­мента ортофосфата (Кулаев, 1975). Реакция трансформации цик­лического полифосфата в линейный была обнаружена у дрожжей.

Таким образом, значительную роль в биосинтезе полифосфатов играет пирофосфат, образование которого у грибов может быть результатом не только процессов биосинтеза нуклеиновых кислот или полисахаридов, но и еще ряда реакций (табл. 6.2). Суммар-

Таблица 6.2

Пути образования пирофосфата у грибов (Кулаев, 1975)

»

Суммарная реакция:

Пирофосфорил-А + В ’ А-В + пирофосфат.

1. Нуклеотидилтрансферазы:

1. Нуклеозид-ТФ+Х , ■ ~*’нуклеозид-МФХ+пипосЬоссЬят

(где Х=аминокислота, жирная кислота или моносахарид и т. п.).

2. Фосфорибозилтрансферазы:

б’-фосфорибозилпирофосфат + У 1 ~|~У-Рибозил-5′-ФосФат + пирофпсфат

(где У=азотистое основание).

ная реакция состоит в сочетании между собой соединений А и В с потерей первым из них пирофосфата, отщепление которого со­провождается выделением энергии, необходимой для этой реакции. К производящим подобные реакции ферментам относятся нуклео­тидилтрансферазы, ацилирующие нуклеозидтрифосфаты с образо­ванием нуклеозидмонофосфатов аминокислот, сахаров или фраг­ментов жирных кислот, и фосфорибозилтрансферазы, переносящие 5′-фосфорибозильную группу на различные азотистые основания.

Кроме того, у дрожжей описана третья реакция, также дающая в качестве конечного продукта пирофосфат и состоящая в отщеп­лении фосфорной группы от высокомолекулярного полифосфата,

конденсирующейся далее с одной молекулой ортофосфата. Однако дальнейшая проверка наличия производящего такую реакцию фермента у Saccharomyces cerevisiae, Endomyces magnusii и Neu — rospora crassa не позволила подтвердить его существование.

Поскольку полифосфаты у грибов являются специализирован­ными донорами фосфора и энергии для биосинтеза различных кле­точных структур, в их обмене помимо синтезирующих имеют зна­чение ферменты, производящие их деградацию и гидролиз. Уже упоминалось о роли в этих процессах полифосфаткиназы бактерий, переносящей фосфорную группу с АТФ на полифосфаты при их синтезе и обратно с полифосфатов на АДФ при их использовании. Первая реакция свойственна только бактериям, тогда как вторая обнаруживается также и у некоторых грибов.

На ферментах этого типа наиболее ярко обнаруживаются осо­бенности биохимической эволюции грибов и прокариот (бактерий и актиномицетов), подтверждающие мнение о различном их про­исхождении и экологической конвергентности их морфологических признаков, например сходства спороношений грибов и актиноми­цетов. Так, помимо различно ведущей себя у грибов и бактерий полифосфаткиназы у бактерий и актиномицетов обнаружен отсут­ствующий у всех испытанных представителей грибов из классов сумчатых, базидиальных, дейтеромицетов и зигомицетов фермент полифосфатглюкокиназа, фосфорилирующий глюкозу за счет от­щепления концевого фрагмента полифосфатов. Этот фермент име­ет узкое значение даже для прокариот, так как обнаруживается толь­ко у их представителей, относимых Красильниковым к классу ак­тиномицетов (актиномицеты, микобактерии, коринебактерии, про — пионобактерии, микрококки и т. д.), что может говорить в пользу их самостоятельной филогении, происходящей от иного корня, чем у Eubacteria. То же относится и к таким переносящим фосфат фер­ментам, как полифосфатфруктокиназа, полифосфатманнокиназа и полифосфатглюконаткиназа, которые также встречаются только у бактерий (Кулаев, 1975).

У грибов, видимо, широко развита дифференцированная в отно­шении разных фракций полифосфатов система полифосфатаз, сре-

Таблица 6.3

Ферменты грибов и бактерий, расщепляющие полифосфаты (1 — полифосфатазы с оптимумом pH 7,1—7,5 / Кулаев, 1975)

1. Полифосфатазы (полифосфатфосфогидролазы):

ПФл-1 + ортофосфат.

ПФд+НгО

2. Олигополифосфатазы:

а) тетраполифосфатаза: 4-ПФ + НгО —

б) триполифосфатаза: З-ПФ + НгО ———

в) пирофосфатаза (бактерии и грибы):

‘ -►3-ПФ + ортофосфат. *тшрофосфат+ортофосфат.

пирофосфат + НгО

■2 молекулы ортофосфата.

ди которых различают категорию полифосфатфосфогидролаз, эк­зоферментов, гидролизующих с отщеплением концевого остатка фосфорной кислоты с образованием ортофосфата и имеющих оп­тимум pH в нейтральной зоне (pH 7,1 —7,5, табл. 6.3).

Рис. 6.8. Влияние катионов на актив­ность полифосфатфосфогидролазы Endo — myces magnusii (Кулаев, 1975)

К этой категории относятся: 1) полифосфатазы, гидролизу­ющие высокомолекулярные пи­рофосфаты; 2) олигополифос — фатазы, гидролизующие тетра-, триполифосфаты и пирофос­фат. Ферменты этого типа, обнаруженные кроме бактерий у Saccharomyces cerevisiae, Еп — domyces magnusii и Neurospo — ra crassa, обычно встречают­ся в форме комплекса. Так, среди комплекса ферментов этого типа у N. crassa выяв­ляются одновременно присут­ствие полифосфатазы, трипо- лифосфатазы, пирофосфатазы и АТФ-азы. Ферменты этой группы являются металлофер- ментами, стимулируемыми или: ингибируемыми двухвалентными катионами металлов, как это можно видеть на примере полифосфатгидролазы E. magnusii на рис. 6.8. Однако действие катионов на активность этих ферментов у разных грибов оказывается

— Таблица 6.4

Удельная активность полифосфатазы в клетках и их органеллах (Кулаев, 1975) Структуры Поли — фосфатаза, мЕ/мг белка Клетки 50 Протопласты 30 Ядра 0 Митохондрии 0 Цитоплазматические мем­ 5 браны Микросомы 2 Г иалоплазма 40

различным. Так, фермент из N. сгазза активируют магний, кобальт, марганец и железо, тогда как для фермента из Е. magnu. sU наиболее эффек­тивны марганец и кобальт, а у дрожжей к магнию и кобаль­ту добавляется никель, сильно угнетающий фермент N. сгаз — Ба. Подобная разнохарактер­ность действия катионов на­блюдается и при рассмотрении их ингибирующего влияния.

Вероятно, вся эта пестрота эф­фектов зависит от катионов, действующих как на сам фер­мент, так и на субстраты реакции, с которыми они образуют ком­плексы, способствующие облегчению или угнетению степени атта — куемости связи —О—Р—О—Р.

Полифосфатазы грибов, как видно из табл. 6.4, локализуются в основном на поверхности клетки, близ локализации высокополи­

мерных полифосфатов, вместе с которыми они вымываются из мембраны после обработки клеток улиточным ферментом.

Вторая категория подобных же ферментов грибов представляет собой эндоформы или деполимеразы, расщепляющие цепи поли­фосфатов с образованием олигополифосфатов или полифосфатных

Таблица 6.5

Ферменты грибов, расщепляющие полифосфаты. Полифосфат — деполимеразы (полифосфатполифосфогидролазы) с оптимальным pH 3,2—3,4, встречающиеся только у грибов (Кулаев, 1975)

Полифосфатполифосфогидролазы.

Тип реакции: ПФ(т+„) + НгО———————— ► ПФт + ПФ„

Табл и ца 6.6

Внутриклеточная локализация полифосфатдеполимеразиой активности у Neurospora сгаььа в мЕ/мг белка -(Кулаев, 1975) Структура Субстрат — фаты с п мономеро НОЙ К п-290 -полифос — числом э фосфор — ислоты /г-180 Целые клетки 8,3 9,4 Протопласты 0,6 1,3 Ядра 0,15 0,20 Митохондрии 0,0 0,0 Микросомы 2,2 — Г иалоплазма 0,0 0,0

цепей меньшей длины, чем исходная. Тип такой реакции показан в табл. 6.5, а результат ее обычно замеряется вискозиметрически. Ферменты этого типа характерны оптимумом в заметно кислой зоне pH (3,2—3,4). Они также активируются металлами, осо­бенно цинком.

Локализация деполимераз еще в большей степени, чем у нейтральных полифосфатаз, привязана к поверхности кле­точной мембраны, поскольку освобожденные от оболочки протопласты сохраняют их ак­тивность в размере порядка только около 0,1 от первона­чальной (табл. 6.6). Есть ос­нования предполагать, что эта категория энзимов может уча­ствовать в переносе с поверх­ности клеточных мембран фрагментов синтезированных на них полифосфатов к другим клеточным структурам, работая таким образом как фосфотрансфе — разы. Регуляция действия всех описанных ферментов обмена по­лифосфатов очень сильно зависит от баланса соотношений поли­фосфатов и ортофосфата, являющегося основным механизмом, регулирующим направление их действия.