МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

Для питания, т. е. для основного обмена грибов, необходимо приблизительно 17—18 элементов, в число которых входят азот, углерод, кислород, водород, сера, фосфор, калий, магний, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций. Вероятно, им также нужно немного кобальта, а по некоторым данным, и галлий, бор, скандий, ванадий. В специальных синтезах (экологического зна­чения) участвует также хлор, например в синтезе хлорсодержащих антибиотиков гризеофульвина и геодина. Возможно, что роль его и более широка.

В большом количестве грибам требуются следующие основные элементы: азот, углерод, кислород, водород, фосфор, калий, сера и магний. Поэтому в питательные среды на водопроводной воде, где достаточно микроэлементов, добавляют кроме источников азо­та и углерода только фосфорнокислый калий и сернокислый маг­ний (источники калия, фосфора, серы и магния).

Методы изучения потребностей грибов в минеральных компо­нентах специально разработаны рядом авторов (Lilly, 1965),

Классический метод (разработан Суейнбергом) состоит в ис­пытании на синтетической среде, очищенной от следов минераль­ных компонентов, с точной их дозировкой. Учет потребности в них производится в основном по интенсивности роста организма.

Функциональный метод состоит в определении элементов, не­обходимых для функции определенных энзимов. Исследуется спо­собность этих элементов образовывать комплексы с энзиматиче­скими белками, например, прн использовании метода парамагнит­ной электронно-резонансной спектроскопии (Nicholas et al., 1962) изучалось образование белковых комплексов у бактерий с железом, марганцем, молибденом и медью.

В работах с минеральными компонентами необходимо учиты­вать два момента.

1. Возможность биологического замещения од­ного компонента другим. Полное замещение встречается редко, но частичное наблюдалось. Таким образом, можно не выя­вить потребность в элементе, если в среде есть его заместитель. Например, в питании Allomyces arbuscula (штамм Burman IDb) кальций можно полностью заменить хромом, стронцием, но строн­ция требуется в 10 раз больше, чем кальция (Lilly, 1965).

Аналогичное явление отмечено для замены цинка при синтезе протеинов, триптофана и других ароматических аминокислот через кадмий у Aspergillus niger (Bertrand, De Wolf, 1960). Калий час­тично замещается у A. niger натрием.

2. Возможность антагонизма ионов. Концентрация необходимого иона может зависеть от концентрации другого иона. Например, для Saccharomyces carlsbergiensis при увеличении кон­центрации натрия в среде нужно увеличивать и концентрацию калия для получения оптимальных условий роста. В результате увеличения концентрации натрия уменьшается усвояемость

калия.

Накопление кобальта и никеля в клетках Torula (Candida) зависит от концентрации в среде магния (Lilly, 1965).

По требуемым количествам элементы питания делят на макро­элементы и микроэлементы. После азота, углерода, водорода, кис­лорода наиболее важные макроэлементы — фосфор и сера. Они участвуют почти во всех биохимических реакциях в живых орга­низмах как энергодающие системы или акцепторы в процессах биосинтеза (при конденсации, циклизации, окислении, восстанов­лении и т. д., являясь компонентами коферментов).

Н2С—SH

Подпись: Н2С—SHСера играет большую роль в структуре клеток, так как она входит в состав белков в виде серосодержащих аминокислот: цис — тина, метионина и др. Сера обеспечивает конформацию, т. е. про­странственную конфигурацию ферментных белков, связывая части полипептидной цепи —S—S-мостиками. Она входит в состав очень реактивных сульфгидрильных соединений (содержащих свободную SH-группу), являющихся источниками водорода при восстанови­тельных реакциях. Тип их трансформации можно видеть на при­мере превращения цистеина в цистин:

НаС—S——————- S сн2

-Н,

2 НС—NHa

Подпись: 2 НС—NHa— не—nh2 h2n—CH

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

ноос

Подпись: нооссоон

Цистин

Так же функционирует трипептид-глютатион, составленный из

-Н,

глютаминовой кислоты, глицина и цистеина: 2GSH—— ► GS—SG

Строение глютатиона:

НООС—CH—СН2—СО— NH—СН—СО—NH—СН2

nh2

Подпись: nh2H2CSH; соон

Глицин

Подпись: Глицин

Цистенн

Подпись: ЦистеннГлютаминовая кислота

Другая функция серы состоит в стимуляции протеолитических ферментов, а отсюда и участие сульфгидрильных соединений в де­лении клеток. Поэтому БН-соединений много в молодых клетках. По некоторым данным, старение белков зависит от понижения их реактивности вследствие образования обильных мостиков ди-

35

Подпись: 352*

Извлекаемые из грибов ферменты, содержащие 8Н-группы (Диксои, Уэбб, 1982)

Класс

ферментов

Фермент

Кофак­

торы

Реакция

Источники

цитохромоксидаза (цитохром а3)

глюта-

тион

Си

4-ферроцитохром с + 02 =

= 4-феррицитохром с+2НгО

широко

распростра­

нены

Окси-

дазы

цитохромперокси-

даза

глюта-

ТИОН

Ре2+

2-ферроцитохром с + Н2Оа = = 2-феррицитохром с+2Н20

плесневые грибы и дрожжи

каталаза

глюта-

тиои

рег+

2Н202 = 02 + 2НгО (донором Н2 может быть этиловый спирт)

широко

распростра­

нены

Транс-

феразы

гликоген-УДФ-глю- козилтрансфера за

БН

Мё2+

УДФ-глюкоза-(-(гликоген)га=

=УДФ+(гликоген)„+1

дрожжи

метионинаденозил-

трансфераза

ЭН

Л^2+М+

АТФ + Ь-метионии + Н20 = =ортофос*ат+пирофосфат + 4 Б — аденЬзилметионин

дрожжи

Лиазы

изоцитратлиаза

БН

Л^2+

Ь — изоцитрат=сукцинат+гли — оксилат

плесневые грибы и дрожжи

Г идрата — зы и дегидра- тазы

аконитатгидратаза

(аконнтаза)

БН

Ре2+

цитрат= цнсакоиитат+ Н20

широко

распростра­

нены

дегидратаза диокси- кислот

БН

М2+

2.3-диоксиизовчлерианат =2- оксоизовалерианат+ Н20

плесневые грибы и дрожжи

имидазолглицеро-

фосфатдегидратаза

БН

Мп2+

О-эритроимидазолглицеро- фосфат=имида золацеталь — фосфат Н20

плесневые

грибы

Изоме-

разы

изопентенилпиро — фосфат изомераза

БН

Мб2+

диметилаллилпирофосфат= и зопентенилпирофосфат

дрожжи

Примечание. М2+ и М+—двух — и одновалентные металлы.

сульфида —S—S—, тогда как активная форма содержит SH-rpyn — пы. Сера входит в состав ряда витаминов: тиамина, биотина и ко — энзима А, участвующего в обмене кислот цикла Кребса, жирных кислот, липоидов и терпенов. Почти все реакции конденсации с присоединением двууглеродных фрагментов идут с участием КоА.

SH-группы являются необходимыми коферментами очень боль­шого количества энзимов, чаще оксидаз, дегидрогеназ и гидратаз, присоединяющих воду (табл. 2.1). Часто функция SH-группы со­стоит в удерживании субстрата реакции в контакте с производя­щим реакцию коферментом (например, витамином) или в фикса­ции кофермента на апоферменте.

Сера в грибах (и в других организмах) в подавляющем числе случаев находится в восстановленной форме как производное се­роводорода H—S—Н, но источником ее могут служить только окисленные соединения (ионы S042- и SCV-), далее восстанавли­ваемые грибами. Сульфиды металлов (FeS, Na2S), как правило, непригодны для питания грибов. Исключение составляет Cerato — stomelia multiannulata (Ophiostoma multiannulatum), не усваиваю­щая сульфатов, а только сульфид аммония, цистин и цистеин (Лилли, Барнетт, 1953) и сапролегнии, нуждающиеся в серосодер­жащих аминокислотах. По Волконскому (Фостер, 1950), они от­носятся к паратиотрофам, а усваивающие сульфаты — к эутиотро — фам. Сера требуется при добавлении ее в питательные среды в сотых или тысячных долях процента, но количество ее в клетках меняется в зависимости от ее концентрации в среде и от концент­рации азота (так как она входит в состав белков) и может коле­баться от 0,1 до 0,5% от массы сухого мицелия (Lilly, 1965).

Фосфор входит в виде ортофосфорной кислоты в нуклеопротея — ды, функцией которых является передача наследственных свойств и синтез белков. В связи с этим он необходим всем живым орга­низмам. В табл. 2.2 представлены обнаруживаемые у грибов со­держащие фосфор нуклеопротеиды.

Накопление нуклеотидов в мицелии грибов соответствует пре­обладающему у данного вида или в данной фазе развития обмену. Например, у хитинообразующих грибов обилен уридинфосфатаце- тилглюкозамин (УДФАГ) в богатых жиром склероциях спорыньи (Claviceps purpurea) — цитидинфосфат, у дрожжей и в молодом мицелии Pйnicillium chrysogenum — АТФ (Белозерский, Кулаев, 1964; Крицкий, 1965; Мансурова, 1966). Датчиками энергии фос­форных связей обычно являются трифосфаты нуклеотидов (реже дифосфаты), но у грибов как источники энергии (связи —О—Р—) еще широко используются неорганические полифосфаты, описан­ные в первой главе, накапливающиеся в мицелии иногда в очень большом количестве (Кулаев, 1975).

Фосфат является также обязательной составной частью боль­шинства кофакторов окислительных, восстановительных, гидроли­тических и декарбоксилирующих коферментов, например НАД и НАДФ. Хотя роль фосфора как непосредственного кофактора фер­ментов кажется незначительной (табл. 2.3), однако почти ни одна

Нуклеотиды, обнаруживаемые в кислоторастворимон (в холодной хлорной или трихлоруксусиой кислотах) фракции Реп1с1Шит сЬ. гу$о£епит или Д^аг/смв Ыврогив

Кислоторастворймые нуклеотиды

В мицелии Pйnici­llium chrysogenum (Мансурова. 1966)

В плодовых телах Agaricus Ыврогиэ (Крицкий, 1965)

АМФ………………………………………………………

АДФ……………………………………………………….

+

АТФ……………………………………………………….

+

УМФ………………………………………………………

+

+

Удф………………………………………………………..

+

+

УДФГ……………………………………………………..

+

УДФ-галактоза………………………………………..

+

—-

УДФАГ………………………………………………….

+

+

ЦДФ……………………………………………………….

+

ЦДФХ (X — этаноламин?)……………………….

+

ГМФ……………………………………………………….

+

+

гдф…………………………………………………………

+

НАД……………………………………………………….

ИМФ………………………………………………………

+

Примечание. Обозначения в списке сокращений. ГМФ — нофосфат. гуанозинмонофосфат.

Т а б л и ц а 2.3

Извлекаемые из грибов ферменты, активируемые фосфором (по Диксону и Уэббу, 1982)

Класс

фермента

Фермент

Кофактор

Реакция

Источник

Редуктаза

НАДФН2-нитратре-

р

НАДФН.+нитрат =

плесневые

дуктаза

флавин

= НАДФ ~|- нитрит +

грибы

Mo

+ н2о

Дезаминаза

уреаза

Р

мочевина + Н20 =

плесневые

= СО» + 2Ш3

грибы

ферментная реакция не обходится без фосфора как донора энер­гии. Весь обмен углеводов идет при обязательном фосфорилиро — вании всех видов сахаров от триоз до седогептулозы, с присоеди­нением от одной до двух молекул фосфорной кислоты, например, глюкозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат и т. д. С участием фос — форилирования протекают все процессы брожения и дыхания.

Вместе с азотсодержащим спиртом и жирными кислотами фос­фор входит в состав фосфолипидов и других эфиров, например фитина (фосфорного эфира инозита).

Фосфор усваивается грибами в виде Р042-, органических фос­фатов и фосфатэфиров и требуется при введении в питательную среду в количестве от 0,1 до 0,2%. Некоторые грибы, например

растущий на среде с целлобиозой Merulius (Serpula) lacrymans, предпочитают органические фосфаты неорганическому ортофосфа­ту. Содержание фосфора в грибах меняется в зависимости от воз­раста: в спорах и в молодом мицелии его всегда больше, чем в старом. Например, у Aspergillus niger на третий день культиви­рования его содержится 12,7 мкг на 1 мг массы сухого мицелия, а на девятый день — 2,4 мкг/мг (Lilly, 1965).

Близкие к этим данным были получены нами (Беккер, Дмит­риева и др., 1972) для культивируемого на среде с кукурузным экстрактом и глюкозой A. fumigatus, где общее количество опре­делявшихся фосфорных соединений достигало 22—25 мкг/мг сухой массы мицелия (или 2,2—2,5%). При этом порядка 20—25% от их количества составляли кислоторастворимые полифосфаты, 4—5%—свободные нуклеотиды и около 70%—РНК. Количество ДНК не превышало 7—9% от общего количества определяемых фосфорных соединений, а соотношение между РНК и ДНК со­ставляло почти целый порядок (РНК было в 7—8 раз больше, чем ДНК (табл. 2.4).

Таблица 2.4

Количество фосфорных соединений в мицелии Aspergillus fumigatus из трехдневной культуры на качалке на среде с кукурузным экстрактом и глюкозой (по Беккер, Дмитриевой и др., 1972)

Первая серия опытов

Вторая серия опытов

Фосфорные соединения

мкг/мг

массы

сухого

мицелия

% к общему количеству фосфорных соединений

мкг/мг

массы

сухого

мицелия

% к общему количеству фосфорных соединений

ДНК

РНК

Мононуклеотиды

Кислоторастворимые полифосфаты Общее количество фосфорных сое­динений

1,95

14,77

0,93

4,29

21,94

8,88

67,31

4,23

19,55

100,00

1,73 16,66 1,39 5,21 24,99

6,92

66,66

5,56

20,84

100,00

Общее количество, % к массе сухого мицелия

2,19

2,50

Для дрожжей указываются еще большие отличия в их концент­рациях, а именно отношение ДНК: РНК составляло 1: 50, а общая концентрация нуклеиновых кислот в ядре не превышала 10% от общего количества в мицелии. Такое высокое преобладание РНК над ДНК в клетке является, видимо, характерным для вегетатив­ных форм роста очень многих грибов и отличает их от других организмов.

Калий требуется грибам в количествах, соизмеримых с фосфо­ром (от 40 до 150 мг на литр среды), поэтому в питательных сре­дах они дозируются вместе в виде фосфата калия. Калий весьма специфичен и заменяется натрием и бериллием только частично. Он активирует ряд ферментов (табл. 2.5).

Из объективных данных можно заключить, что при недостатке калия у Aspergillus niger образуется много щавелевой кислоты, т. е. происходит неполное окисление и выделяется NH3 вследствие торможения синтеза или аминирования органических кислот и от­сюда торможения синтеза белка. При достаточном количестве ка­лия и недостатке витамина В] происходит торможение декарбок-

Таблица 2.5

Извлекаемые нз грибов ферменты, активируемые иоиом калия (Диксои, Уэбб, 1982)

Класс

ферментов

Фермент

Кофак­

торы

Реакция

Источники

Дегидро­

геназы

альдегиддегидро-

геназа,

к+

альдегид + НАДФ + Н20 = = кислота + НАДФН2

дрожжи

Синте-

ацетилкоэнзимА-

к+

АТФ +ацетат+КоА=АМФ+

дрожжи

тазы

синтетаза

Mg2+

+ пирофосфат + ацетилКоА

пантотеиатсиите-

к+

АТФ+1-пантоат+ Р-алаини=

плесневые

таза

Mg2+

+АМФ+пирофосфат+1 — паи — тотенат

грибы

НАД-сиитетаза

I

к+

Mg2+

АТФ -(- дезамидо-НАД-Ь-глу- тамин + Н20 = АМФ -)- пирофосфат-НАД Ь-глу- тамат (можно вместо глута­мина использовать ЫН3)

дрожжи

силирования продуктов углеводного обмена и накапливается пировиноградная кислота, следовательно, калий участвует в син­тезе кетокислот (Lilly, 1965). Механизм действия калия на обмен углерода стал выясняться при изучении его роли в проницаемости и усвоении минеральных компонентов среды и в поддержке в клет­ке изменяющегося при дыхании и брожении нормального баланса ионов, особенно концентрации Н+.

Оказалось, что К+, Na+ и Н+ имеют одинаковый переносчик через мембрану, но сродство этого переносчика к натрию в 20— 25 раз ниже, чем к калию, что и объясняет незаменимость калия в обмене. В отсутствие К+ (компенсатора) концентрация Н+-ионов в клетке должна повышаться до непереносимого белками плазмы предела вследствие накопления кислых продуктов дыхания и бро­жения и всасывания анионов, прежде всего Н2Р04~. Отсюда ком­пенсация понижения pH при недостатке калия осуществляется в форме выделения NH3.

Сбалансированное усвоение организмами калия н фосфора объясняется тем, что фосфорная кислота в клетке ведет себя как обменная система анионов Н2Р04_ и ОН-. При усвоении ее среда подщелачивается, а клеточное содержимое подкисляется. Однако К~ способен входить в клетку наравне с Н+ и в 5 раз быстрее других катионов, но обратное вытекание его из клетки в 30 раз меньше, чем Н+ (из клетки способно выделяться 20 мкмоль/кг/ч к+ против 600 мкмоль/кг/ч для Н+). Поэтому концентрация калия в клетке (при pH 6,0) может достигать 200 мкмоль/кг, а Н+ только 0,001 мкмоль/кг и вытекание Н+ из клетки при этом не прекра­щается.

Таким образом, К+ всасывается из среды избирательно, даже когда внутренняя концентрация его в 5000 раз больше наружной. Натрий всасывается в 20 раз слабее калия, а выделяется намного быстрее.

Следовательно, калий непосредственно не участвует (Rothstein, 1965) в реакциях метаболизма, как микроэлементы и сера, в их энергетическом снабжении, как фосфор, или в композиции кле­точных структур, как азот, кислород, водород и углерод. Его функ­ция состоит в конструировании механизма обмена с внешней сре­дой и в поддержании нормальных для обмена физико-химических условий гН, pH, баланса ионов в клетке.

Магний очень необходимый элемент. Потребность в нем близка к потребности в сере, что является обоснованием для применения его в средах в виде MgS04. Aspergillus niger требуется для опти­мального роста 20 мг/л Mg2+, Allomyces arbuscula — 9 мг/л.

Содержание магния в мицелии зависит от возраста культуры и типа источника азота. Так, клетки трехдневной культуры мице­лия A. niger на среде с аммонийным азотом содержали 0,13%, а с нитратным — 0,26% магния (Lilly, 1965). Можно искусственно обогатить мицелий магнием на богатой им среде.

В дрожжах концентрация магния достигает 292 мкг/кг сырых клеток, но они плохо растут без достаточного количества калия в среде. Эти соотношения объясняются значением калия для усвое­ния Н2Р04~ и ролью магния в фосфорилировании. Магний является составной частью (кофактором) фосфатаз. Внешне это проявля­ется в согласованном усвоении обоих элементов: на каждые 36 ато­мов фосфора требуется 1 атом магния.

Магний играет большую роль в углеводном обмене и всех син­тезах на основе использования энергии фосфорных связей. Около 50 ферментативных реакций у грнбов идут с участием магння. Так, 18 фосфокиназ осуществляют фосфорилирование и перенос энергии фосфорных связей с одного соединения на другое, 16 транс — фераз осуществляют с помощью энергии фосфорных связей синте­зы с переносом углеродсодержащих фрагментов с одного соедине­ния на другое. Ряд фосфатаз производят отщепление Н2Р04_, ряд синтетаз осуществляют конденсацию с участием фосфорилирова — ния. Другие ферменты также действуют при участии магния (му — тазы, изомеразы, лиазы и редуктазы) (Диксон, Уэбб, 1982).

В синтетазах магний участвует преимущественно совместно с калием. По-видимому, все же не все фосфатазы связаны именно с магнием, так как, например, он активирует у Pйnicillium chryso — genum ферменты, деполимеризующие мета-, пирофосфаты, АТФ при pH 6 и подавляет их при pH 3,5. С другой стороны, он воз­вращает активность фосфатазам, инактивированным цианидом (Sadasivan,. 1965).

На пектиновые энзимы он влияет также различно в зависимо­сти от оптимума их pH, подавляя энзимы Botrytis cinerea с опти­мальным pH 4—5 и активируя энзимы Pythium debarianum с оп­тимальным pH 8—9 (Ashour, 1954). Магний способен нейтрализо­вать действие ряда ядов (сулемы, борной кислоты) возможно вследствие антагонизма ионов. Магний сильно угнетает одни био­синтезы биологически активных веществ (например, токсинов уров — ской болезни у Fusarium sporotrichiella var. роае — представляю­щих собой стероиды или трихотецины) и стимулирует другие (например, образование янтинеллина у P. janthinellum (Беккер, 1963).

Кальций в золе грибов содержится от нескольких единиц до 50%. Особенно часто он встречается в виде щавелевокислого каль­ция, например в мицелии Merulius (Serpula) Iacrymans. Нередко кальций играет роль нейтрализатора избытка органических кислот, образующихся в обмене многих грибов. В отсутствие его урожай мицелия Aspergillus niger и Fusarium снижается. У некоторых водных форм грибов, например у Allomyces arbuscula, он принад­лежит к числу обязательных элементов (Lilly, 1965) и участвует в транспорте аминокислот. Ион Са2+ является также необходимым элементом для роста оомицета Phytophthora infestans, оптимально эффективным в концентрации от 50 до 500 мкМ (Окороков и др.,

1976) (рис. 2.1). Специфичным переносчиком Са2+ в мицелии и

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

lg[Ca2+] Время инкубации, мин

і———- 1 і————— 1—- 1

10 )00 500 то 9000

[Са2+], мкМ

Рис. 2.1 Рис. 2.2

Рис 2.1. Влияние концентрации кальция иа рост Phytophthora infestans. 1—мас­са сухого мицелия; 2 — накопление в нем Са,+ (Сысуев. 1979)

Рис. 2.2 Влияшк Mg2"1 — АТФ (10 мкМ). Mg2“ РРП (Н> мкМ) и Mgs-t (ПФі (1 мкМ* иа поглощение “Са (1 мкМі проростками Phvtuphthora infestans-, К — контроль (Cucveii I РТР’.

донором энергии оказалась магниевая соль пирофосфата (РРн), тогда как магниевые соли АТФ и полифосфатов (ПФЛ) ингибиро­вали этот процесс (рис. 2.2; Сысуев, 1979). Неорганический фос­фат не проявлял действия (Okorokov et al., 1978). Участвующая в освобождении энергии для переноса Са2+ в клетку пирофосфа — таза теряла активность при избыточном введении ионов Са2+ в среду при инкубации in vitro (выше 5 мкМ), что должно вести к прекращению транспорта этого элемента в клетку (Сысуев и др., 1977; Сысуев, 1979). Оптимальная доза Са2+ для роста Phyto­phthora infestans находится в пределах от 50 до 500 мкМ на грамм сухого мицелия, что составляет порядка от 0,2 до 2 мг на 1 литр культуральной среды. Роль иона кальция для метаболизма Р. in­festans в этих работах осталась не вполне ясной. Наблюдаемой в присутствии Са у другого оомицета Achlya стимуляции транс­порта аминокислот установить не удалось у Phytophthora (Сысуев и др., 1977). Возможно, что Са замешан в функции проницаемости клеточных мембран этого гриба.

Кальций является составной частью (коферментом) ряда гид- ролаз (табл. 2.6), например а-амилазы и некоторых гидролаз цик-

Т абл ица 2.6

Извлекаемые из грибов гидролитические ферменты, содержащие Са2+

(Диксон, Уэбб, 1982)

Фермент

Кофактор

Реакция

а-Амилаза

Са2+

гидролиз а-1,4-глюкановых связей полисаха­ридов с 3 и более остатками а-глюкозы (крах­мал, гликоген и родственные им полисаха­риды)

гидролиз одной а-1,4-глюкановой связи цик- логептаглюкана с образованием линейного гептаглюкана

Циклогептаглюканаза

Са2+

Циклогексаглюканаза

Са2+

гидролиз одной а-1,4-глюкановой связи цик- логексаглюкана с образованием линейного гексаглюкана с концевой ^-конфигурацией (инверсия)

лических полисахаридов (Диксон, Уэбб, 1982). Вероятно, в силу конкуренции с магнием кальций может подавлять активность не­которых фосфатаз у Pйnicillium chrysogenum (Sadasivan, 1965).

Микроэлементы (или следовые элементы) необходимы для об­мена в незначительных количествах (тысячных и десятитысячных долях процента, по Стайнбергу, от 0,3 до 0,02 мг/л). К ним отно­сятся железо, цинк, медь, марганец, молибден, кобальт, бор и не­которые другие (для грибов также галлий, скандий). Они входят в состав ферментов. Для изучения потребности в микроэлементах у грибов большую роль сыграли работы Стайнберга (1919), ис­следовавшего ее на модели Aspergillus niger.

Железо — микроэлемент, требующийся в наибольшем количе­стве (0,001%), его даже добавляют в среды на водопроводной во­де, например в среду Чапека. На среде без железа урожай A. niger снижается в 70 раз. Усваивается железо в основном в форме рас­творимых неорганических солей (сульфатов и хлоридов), но неко­торые грибы удовлетворяются хелатами железа органического происхождения (гемы, цитохромы и другие), например Pilobolus (Page, 1962, цит. по Lilly, 1965). Железо входит в состав ряда важных окислительных ферментов со структурой порфиринов, особенно участвующих в дыхательной цепи и цикле Кребса (табл. 2.7).

Таблица 2.7

Извлекаемые из грибов оксигеиазы, гидратазы и дегидрогеназы, активируемые Fe2+ (Диксон, Уэбб, 1982)

фермент

Кофактор

Реакция

Источники

Протокатехинатоксиге-

Fe2+

протокатехинат + 02 = 3-карбок-

плесневые

наза

сицисмуконат

Грибы

Аконитатгидратаза

Fe2+

цитрат=цисаконитат + НгО

широко рас­

(аконитаза)

SH

пространены

Сукцинатдегидрогена-

флавин

сукцинат -)-акцептор=фумарат-)-

дрожжи

за

Р

-f — восстановленный акцептор (акцептор феназиналкилсульфат)

К числу ферментов, содержащих железб как кофактор, относят каталазу, пероксилазу, цитохромы b и с, цитохромоксидазу и цито — хромпероксидазу, но, кроме того, оно активирует ряд других фер­ментов. Механизм участия железа в окислительных реакциях пред­ставляют обычно следующим образом: Fe2+—л«=fcFe3++к. Сброс электрона с двухвалентного железа сопровождается выделением энергии. Специфическое влияние железа на обмен A. niger состоит в усилении процессов окисления: при дефиците железа образуется больше лимонной кислоты и меньше щавелевой, т. е. в присутствии его достигается более высокая степень окисления. Ввиду того что железо играет роль в некоторых этапах восстановления нитратов, в присутствии его в достаточных количествах некоторые грибы усваивают помимо обычного для них иона NH4+ еще и ион N03~.

Кроме того, ионы железа обладают способностью резко усили­вать активность некоторых антибиотиков, например ликомаразми — на у Fusarium oxysporum f. lycopersici. Однако все случаи участия железа в обмене не полностью обосновывают высокую потребность в нем. Более детальный анализ показал, что в окислительных фер­ментах участвует не более 20% требующегося для нормального обмена количества железа.

До 80% железа оказалось содержащимся в клетках в форме неорганических комплексов с фосфорной кислотой (Кулаев, 1975). Эти соединения, видимо, представляют собой механизм депониро­вания и детоксикации отщепляющегося при синтезах ортофосфата.

Этот механизм может быть основой для объяснения сходства симп­томов хлороза (недостаток железа) и паразитарных токсикозов растений (тоже хлороз), при которых наблюдается как разобщение окислительного фосфорилирования (сброс Н3РО4 без обратного включения в АТФ), так и хелирование железа токсинами парази­тов (тогда хлороз является результатом накопления не связанной с железом фосфорной кислоты).

Физиологическое действие металлов часто резко возрастает при их сочетании. Эффект действия на грибы железа сильно возрастает в присутствии цинка. В опытах Стейнберга масса сухого мицелия Aspergillus niger без железа и цинка была равна 18 мг, в присут­ствии одного железа — 44, одного цинка — 40, в присутствии желе­за и цинка — 731 мг вместо 44+40=84 мг, если бы эффекты этих микроэлементов просто складывались. Это можно связать с по­следовательным участием обоих элементов в ферментах дыхатель­ной цепи (в первых ступенях ее — цинк, в последующих — железо).

Оба этих элемента участвуют также в активизации пектиновых энзимов у возбудителя вилта хлопчатника Fusarium oxysporum f. vasinfectum, для которого оптимальная концентрация железа составляет 20—40 мг/кг почвы (при тех же концентрациях маг­ния), а оптимальная дозировка цинка 20 мг/кг почвы (Sadasivan, 1965).

Цинк необходим для очень многих обменных процессов. По­требность в нем доказана для ряда видов Aspergillus, дрожжей, мукоровых грибов, например Rhizopus nigricans, и других зиго — и оомицетов, для ряда сумчатых грибов, патогенных грибов, возбу­дителей дерматомикозов и т. д. Основная роль цинка как кофак­тора дегидрогеназ, участвующих в углеводном обмене (табл. 2.8), демонстрируется его влиянием на экономический коэффициент (на увеличение массы сухого мицелия, отнесенного к весу использо­ванных углеводов) и на увеличение выделения С02 (на повышение энергии дыхания).

При недостатке цинка окисление субстрата идет не полностью и в среде получается много побочных продуктов обмена, например органических кислот. В присутствии цинка их образование подав­ляется. Если источником углерода являются органические кисло­ты— винная, янтарная, глюконовая и т. д., то влияние дефицита цинка проявляется много слабее, что объясняется его участием в цикле дикарбоновых кислот Кребса. Цинк участвует в образо­вании, вовлечении в дальнейший обмен и превращении в амино­кислоты многих окси — и кетокислот.

Образование фумаровой и молочной кислот у Rhizopus снижа­ется при повышении концентрации цинка, что объясняется его участием как кофермента в дегидрогеназах молочной кислоты, D-2-оксикислот, а также алкоголя, глицеральдегида и т. д. (см. табл. 2.8). Специфичная необходимость цинка для обмена была показана при попытке замены его химически близким кадмием, который мог пополнить дефицит его только при наличии в среде не менее 25 мкг/л исходного количества цинка, и оптимальное ко-

Извлекаемые из грибов дегидрогеназы, содержащие Zn2+

(Диксон, Уэбб, 1982)

Фермент

Кофактор

Реакция

Источники

Алкогольдегидрогена-

за

Zn

алкоголь + НАД = альдегид или кетон + НАДНг

дрожжи

D-лактатдегидрогеназа

Zn

флавин

О-лактат + феррицитохром с = = пируват +ьферроцитохром с

дрожжи

Г алактозооксидаза

Zn

О-галактоза -(-02 = галактогек- содиальдоза + Н202

плесневые

грибы

Дегидрогеназа

D-2-оксикислот

Zn

флавин

В-лактат+акцептор=пирувэт -)- восстановленный акцептор

дрожжи

Глицеральдегидфосфат-

дегидрогеназа

Zn

О-глицеральдегид-З-фосфат-)- [-НАД=1,3-дифосфо-Б — глице­риновая кислота + НАДН2 (действует и на другие альде­гиды)

широко

распростра­

нены

Глютаматдегидрогеназа

Zn

Ь-глютамат + Н20 НАДФ = + 2-оксигЛутарат -)- N1^ 4- + НАДФН2

личество кадмия на этом фоне (450 мкг/л) почти вдвое превышало оптимальное количество цинка (250 мкг/л), требуемое в этих ус­ловиях (Bertrand, de Wolf, 1961).

Специфический эффект цинка в отношении синтеза у Aspergil­lus niger аминокислот оказался наиболее выраженным для арома­тических аминокислот с бензольным ядром: в первую очередь фе­нилаланина, а затем триптофана и тирозина, причем замена цинка в этом синтезе кадмием была возможна только для триптофана и тирозина.

Подавление триптофансинтетазы при цинковом голодании было показано для Neurospora. При недостатке цинка у A. niger подав­ляется (хотя возможно вторично, в результате угнетения обмена углеводов) и синтез алифатических аминокислот—аланина, гли­цина, пролина, треонина, серина, валина, лейцина, изолейцина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Влияние цинка на углеводный обмен A niger сказывается и на синтезе нуклеиновых кислот, в котором в первую очередь, вероят­
но, страдает биосинтез рибозы и дезоксирибозы. Для них замена цинка через кадмий имеет слабый эффект (Bertrand, de Wolf, 1961). Какие именно из шести известных цинкозависимых энзимов гликолитического и пентозного циклов играют здесь основную роль, сказать трудно. Это могут быть как зависящие от цинка в процессе их синтеза глюкозоизомераза, фосфофруктокиназа и глицеральде — гидфосфатдегидрогеназа, так и содержащие цинк в качестве ко- энзима глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, 6-фосфоглюконатдегидро — геназа и особенно сильно зависящая от цинка альдолаза.

Участие цинка в образовании многих энзимов объясняется его особой ролью в синтезе их коферментов (ароматические амино­кислоты, аминокислоты, НАД и т. д.), что отражается на проду­цировании биологически активных веществ и других веществ спе­циального экологического назначения, образующихся в боковых путях обмена. Например, цинк, введенный в концентрациях, в 1000 раз превышающих концентрацию, оптимальную для роста (для роста достаточно 0,001 мг%), резко усиливает образование цитохрома и цитохромоксидазы у Usоilago sphaerogena.

Цинк сильно влияет на образование некоторых токсинов, на­пример токсина уровской болезни (поина) у Fusarium sporotrichi — ella var. poae и других соединений стероидной структуры (Беккер, 1963). Он влияет на образование фузариевой кислоты у F. oxyspo — rum f. vasinfectum (возбудитель фузариозного вилта хлопчатника), стимулируя его в концентрации около 250 мкг/л и угнетая при 400 мкг/л (рис. 2.3) (Kalyanasundaram, Saraswathi — Devi, 1955).

Действие цинка на формирование способности возбудителя вил­та образовывать фузариевую кислоту в онтогенезе культуры про-

Ч &

N. &

$ £

* gl

»l|l if’

‘*°s l! iw,

о I

М

100 s

»!

£0-

100 Ъ’ЪЦЧКонтропьОЛ 0,2 0,3 0,4 0,5 Ofi 0,7

5 s 11 без цинка Концентрация цинка,

*= мг/л или мг/кг почвы

! н I*

А п

X ^ и

Рост

2 k 6 8 10 Содермание цинка, мкг! ZS мл среды

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ
МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

Рис. 2.3

 

Рис. 2.4

 

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

Рис 2 3. Действие цинка на рост и антибиотическую активность Fusarium oxys-

porum f. vasinfectum

Рис 2.4. Зависимость образования фузариевой кислоты в лабораторной куль­туре от концентрации цинка в среде (/), активность штаммов возбудителя вил­та, выделенных из почвы с различным содержанием циика (2), и интенсивное«: заболевания хлопчатника вилтом (3) на тех же почвах (Беккер Полетаева

1971)

является и как селекционирующий фактор. В почве при разной концентрации цинка формируются популяции охузрогит, вос­производящие уровни активности фузариевой кислоты, свойствен­ные исходной культуре при разных концентрациях цинка в пита­тельной среде (рис. 2.4) (Беккер, Полетаева, 1968). Уровень вил — тового токсина в хлопчатнике также воспроизводит эту кривую токсичности популяции возбудителя. Сопоставление данных спект — рофотометрии пиридинов и активности фузариевой кислоты этих популяций показывает, что увеличение концентрации цинка в почве выше оптимума для синтеза фузариевой кислоты снижает только

D, k О,7 2,0 5,0 10,0

Концентрация цинка, мг/кг почбы

Подпись:ее синтез, но продолжает увели­чивать способность к образованию* нетоксичных соединений этого ря­да (Беккер, Полетаева, 1971) (рис. 2.5). Цинк способствует так­же образованию многих пигмен-

Рис. 2.5. Изменение способности попу­ляций Fusarium oxysporum f. vasinfec — tum к образованию фузариевой кислоты (4) и других пиридинов, определяемых спектрофотометрическим (2) и биологи­ческим (3) методами, и присущая им интенсивность заболевания (/) при их формировании в почве с различными до­зами цинка (Беккер, Полетаева, 1971)

тов, например меланина у Macrosporium и хризогенина у Pйnicil­lium chrysogenum.

Медь имеет более ограниченное значение, чем железо и цинк„ однако и она принадлежит к числу необходимых для грибов мик­роэлементов. Она требуется Aspergillus niger в количестве порядка

0, 4 мг/л. Однако у Nectria galligena рост продолжает усиливаться и при концентрациях в 10 раз выше. Сильное влияние меди на рост N. galligena объясняется большой ролью ее в обмене тирози — назы (полифенолоксидазы, окисляющей тирозин), присутствующей у многих грибов, особенно у микоризообразующих базидиомицетов. Возможно, что медьсодержащие энзимы этого типа играют у ряда грибов роль в их энергоснабжении.

Кроме тирозиназы медь входит в состав таких оксидаз, как лакказа (полифенолоксидаза), оксидаза аскорбиновой кислоты, оксидаза цитохрома а3, уратоксидаза (табл. 2.9), и участвует в этапах восстановления нитратов на ступенях нитрит — и гипонитрит- редуктаз (Lilly, 1965). У A. niger она играет роль при образовании и использовании лимонной кислоты (рис. 2.6). При добавлении в среду цитрата его потребность в меди заметно падает.

Как железо и марганец, медь сильно влияет у грибов на спо­рообразование и пигментацию спор. По этому признаку с помощью A. niger можно обнаружить концентрации меди в среде порядка

Извлекаемые из грибов оксидазы, содержащие медь (Диксон, Уэбб, 1982)

Фермент

Кофактор

Реакция

Источники

Уратоксидаза (урика — за)

Си

урат -)- 0-2 = неидеитифицирован — ные соединения

адаптиро­

ванные

дрожжи

Катехолоксидаза (фе — нолоксидаза, тирози — наза)

Си

2-0-дифенол f — 0.2 = 2-о-хинон ~ f — 2Н20 (действует на разные ди — и монофенолы)

грибы

Цитохромоксидаза (ци­тохром а3)

Си

глют.

4-ферроцитохром с + 02 = 4-фер — рицитохром с -)- 2HjO

широко

распро­

странены

п-Дифенолоксидаза (полифенолоксидаза, лакказа)

Си

2-п-дифеиол + Oj = 2л-хиион — j-

+ н2о

грибы

0, 05 мкг/50 мл. Медьсодержащие оксидазы, видимо, участвуют также в образовании меланиновых пигментов грибов (табл. 2.9).

Потребность в меди была доказана для A. niger, A. flavus, Rhizopus sp., Sclerotium rolfsii, Cercospora nicotianae, Fusarium oxysporum, Pythium inegulare, Thielavia basicola (Steinberg, 1950). Не исключается, что медьсодержащие оксидазы участвуют также в детоксикации ароматических антисептиков для древесины типа креозота, начиная, таким образом, сукцессию грибов на обрабо­танной ими древесине. Первыми поражают ее грибы, содержащие меланины.

Марганец нужен грибам в очень небольшом количестве поряд­ка 1 : Ю9. Однако он играет существенную роль в обмене как ко­фактор щавелевоуксусной и щавелевоянтарной карбоксилазы — фермента, участвующего в основной реакции усвоения С02 у ге — теротрофов путем присоединения ее к энолпировиноградной кис­лоте. Общее число обнаруженных у грибов ферментов, где марга­нец является кофактором (табл. 2.10), невелико, и они главным образом участвуют в трансформации органических кислот цикла Кребса.

Марганец вместе с медью участвует как кофактор в образова­нии и потреблении лимонной кислоты у Aspergillus niger и пред­положительно — в ее синтезе как кофермент аконитазы. Некоторую роль играет марганец и в азотном обмене, активируя аргиназу дрожжей и входя в состав гидроксиламинредуктазы у плесневых грибов (Диксон, Уэбб, 1982). Последний энзим был обнаружен у Neurospora crassa при восстановлении этим организмом гидрок — силамина в аммиак (Lilly, 1965).

Марганец специфично угнетает образование пектолитических энзимов у Fusarium oxysporum f. vasinfectum, конкурируя при этом с железом. При соотношении железа и марганца 1:2 образование пектиновых энзимов у этого паразита хлопчатника падает и соот­ветственно снижается вызываемое им заболевание хлопчатника фузариозным вилтом (Sadasivan, 1965).

SAM

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ ГРИБОВ

-Рис. 2.6. Влияние меди на изменение массы мицелия (1) и содержание лимонной кислоты (2) в культуре Aspergillus niger. Увеличение количества меди в среде выше 6—7 мкг/л приводит к снижению количества лимонной кислоты в куль­туральной жидкости (Bertrand, de Wolf, 1960)

Рис. 2.7. Интенсивность заболевания хлопчатника фузариозным вилтом (и. в.— 1) и накопление в нем переносчика метильных групп S-аденозилметионина {SAM — 2) при различных дозировках кобальта в почве (Беккер, Полетаева,

1971)

Молибден требуется грибам в наименьшем количестве по срав­нению с другими микроэлементами; обнаружено до сих пор его участие всего в одном метаболическом процессе — восстановлении нитрата в нитрит (первый этап пути восстановления соединений азота осуществляется системой нитратредуктаз). Вероятно, с этим процессом связано участие молибдена в фиксации атмосферного азота у бактерий и сине-зеленых водорослей, в котором играет основную роль система ферментов, названная нитрогеназой (Кре — тович, 1972). Этим объясняется также, что Aspergillus niger на среде с солями NO3- требует больше молибдена, чем на среде с NH4+. Молибден является коэнзимом нитратредуктазы, что под­тверждается реактивирующим эффектом добавки молибдена к нит ратредуктазе A niger, инактивированной цианидом

Извлекаемые из плесневых грибов дегидрогеназы, редуктазы, дегидратазы и лиазы, содержащие Мп2+ (по Диксону, Уэббу, 1982)

Фермент

Реакция

Изоцитратдегидрогеназа

Г идроксиламинредуктаза

Имидазо л глицерофосфатде — гидратаза

Оксалацетаза (оксалацетат — лиаза)

Ь-изоцитрат + НАД = 2-оксиглутарат + С02 +

+ надн2

Ь-нзоцитат + НАДФ = 2-оксиглутарат + С02 + +НАДФН2 (декарбоксилирует также оксалсукци — нат)

ЫН3 + акцептор Ц* ИН2ОН -|- восстановленный ак­цептор (доноры водорода флавины)

О-эритроимидазол глицерофосфат = имидазолацетол — фосфат + НчО

оксалацетат +Н.20 ^ оксалат + ацетат

В других этапах пути восстановления ЫОз~ кроме молибдена участвуют медь, железо, марганец:

Мо Си, Ре Си, Ре Мп

NOr —

-N07

—- ►NO

ИЛИ

n2o2

Нит-

Нит­

Гипо­

р:-.т

рит

нитрит

Подпись:“ —*Ш2ОН—- *ын3.

возможно Со

Гидроксил — Амми-

амин ак

Дефицит молибдена у грибов наблюдается редко, однако он воз­можен в условиях избытка конкурирующей с этим элементом ме­ди. Наоборот, дефицит меди в результате присутствия избытка молибдена в почве мы наблюдали в Ферганской долине, что отра­зилось на торможении образования антибиотиков типа геодина у почвенных грибов, антагонистов возбудителя вилта.

Хлор необходим грибам в основном для синтеза хлорсодержа­щих антибиотиков: геодина (A. terreus), гризеофульвина (Pйni­cillium nigricans, P. urticae и P. janthinellum), хлорсодержащего метаболита калдариомицина (Caldariomyces fumago), нидулина (A. nidulans), налгиолаксина (P. nalgiovensis) (Miller, 1961). Однако y грибов известен один фермент, в составе коферментов которого имеется хлор (табл. 2.11), это арилсульфатаза-эстераза, расщепляющая ароматические эфиры серной кислоты (Диксон, Уэбб, 1982).

Кобальт принадлежит к числу микроэлементов, обязательных для животных и бактерий, участвуя в составе витамина Bi2 в син­тезе метионина и тимидиновой части нуклеотидов ДНК. Выясня­ется также, что, видимо, он участвует в последнем этапе системы нитратредуктазы (или нитрогеназы), способствуя восстановлению гидроксиламина в аммиак (Ягодин, 1970). Однако необходимость кобальта для грибов пока подтверждена слабо, так как очистить от него среду до уровня, выявляющего его дефицит, пока не уда-

Извлекаемые из грибов ферменты, активируемые Мо и СГ ‘(Диксон, Уэбб, 1982)

Фермент

Кофактор

Реакция

Источники

НАДФН2-нитратредук-

Мо,

НАДФН-2 -4- нитрат = НАДФ +

плесневые

таза

флавин,

Р

+ нитрит + Н20

грибы

Арилсульфатаза (эсте-

С1~ (в неко­

фенолсерный эфир + Н20 =

плесневые

раза)

торых

случаях)

= фенол + H2S04

грибы

лось, вероятно, вследствие очень малых необходимых количеств кобальта для синтеза ДНК ядер, имеющих у грибов очень малые размеры, особенно в вегетативном мицелии.

Тем не менее существование потребности в витамине В12 ■у дрожжей (Kloeckera brevis), на которых можно его тестировать, и данные о способности к его синтезу у Aspergillus niger (Lilly, 1965) подтверждают необходимость его для грибов. Для экологии грибов-паразитов существенно, что кобальт усиливает метилирую­щие системы, в частности накопление переносчика метальных групп, S-аденозилметионина, приводящие к детоксикации фитоток­синов грибов, например фузариевой кислоты при вилте хлопчат­ника (Полетаева, 1969; Беккер, Полетаева, 1971; рис. 2.7, табл. 2.12).

По некоторым данным, в определенных условиях у грибов ■встречается потребность еще в нескольких микроэлементах. На­пример, галлий по данным Стейнберга стимулирует рост A. niger при добавлении его в количестве 0,02 мг/л, 76 других испытанных микроэлементов не заменяли его.

Скандий оказался необходимым для A. niger при росте его на глицерине как источнике углерода, но на средах с сахарами по­требность в нем отсутствовала.

По некоторым данным, бор также способствует росту и разви­тию грибов.

Существуют микроэлементы, которые сами по себе не необхо­димы, но влияют на усвоение других микроэлементов и могут час­тично заменить их или изменить направление обмена и нарушить — баланс обменных процессов.

На фоне избытка необходимых микроэлементов они не влияют на рост, развитие и обмен, но при недостаточных дозах влияют очень сильно как в случае естественного недостатка их в природе, так и при дефиците, создаваемом действием многих неметалличе­ских ингибиторов, таких, как СО, мышьяк, группы SH, CN и другие.

Приведем примеры известных микроэлементов — заменителей и конкурентов.

хроматографический анализ экстрактов 4,5 и. НС104 из свежих растений хлопчатника, выросших иа вилтовом фоне без добавки в почву кобальта ^контроль) и с добавкой в иее 0,2 и 2,0 мг/кг СоС12. Система растворителей: этанол — вода — уксусная кислота (65 : 34 : 1). Проявление пятен нингидрином (Беккер, Полетаева, 1971)

№ пяти а хрома-

Rf экстрактов из контроль­ных растений

Добавка 0,2 мг Со на 1 кг почвы

Добавка 2,0 мг Со на 1 кг почвы

И Г вещества на хромато­грамме в той же системе (по данным литературы)

-тограм-

мы

площадь

площадь

№ 1

№ 2

Rf

пятна,

Rf

пятна,

Rf

вещество

мм[1]

мм[2]

1

0,19

1190

2

0,23

756

0,23

аде нози нтрифосфат

3

0,31

960

0,31

3404

0,30

S-аденозилметио ни н

4

0,36

0,37

0,35

8448

5

0,40

1944

0,41

1140

0,44

аденозин-5-моно-

фосфат

6

0,53

0,48

0,54

5311

0,53

9450

0,59

аденозин

7

0,55

0,62

1170

0,63

аденин

8

0,64

2400

0,63

гомосерин

9

0,65

0,66

0,65

3127

10

0,72

0,72

метионин

11

0,75

0,75

метилтиоаденозин

12

0,83

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *