Органический азот усваивается главным образом в форме аминного азота аминокислот, пептидов и белков. Белки и пептиды перед усвоением расщепляются протеолитическими ферментами, аминокислоты могут усваиваться целиком. Рост грибов лучше обеспечивается смесью аминокислот, чем отдельными из их числа. Неспособны использовать ион NH4+, и нуждаются в готовых аминокислотах некоторые хитридиомицеты и оомицеты, например Blastocladiella emersonii, Sapromyces elongatus и Leptomitus lac — teus, а также Saprolegnia parasitica. Из других групп грибов нуждаются в готовых аминокислотах в основном паразиты, как Ophio — bolus graminis или Trichophyton mentagrophytes. Лучше всего они используют содержащий смесь аминокислот гидролизат казеина. Дрожжи также лучше используют аминокислоты, чем ион аммония или нитрат. Бывают случаи, когда усвоение одних аминокислот угнетается присутствием в среде других (Nicholas, 1965). Усвоение аминокислот зависит также от возраста культуры, от pH "Культуральной среды и от концентрации в ней аминокислот, как это было показано методом изотопов для Botrytis fabae.
Аминокислоты с более короткой цепью лучше усваиваются грибами, чем с длинной. Например, аспарагин хорошо усваивается видами рода Aspergillus (Agnihotri, 1966), аланин Fusarium оху — sporum (Said, Harhash, 1966). L-изомеры обычно усваиваются значительно лучше, чем D-изомеры или рацематы, так, это наблюдается у миксомицетов (Cotter, Raper, 1966) или у Phytophthora parasitica и Verticillium albo-atrum, плохо усваивающих D-аланин. D-аминокислоты не могут быть прямо включены в обмен как природные L-формы и обычно используются после их дезаминирования с помощью оксидазы D-аминокислот и трансформируются в кетокислоты, что осуществляется с различной скоростью для разных компонентов их смеси. При усвоении L-аминокислот, видимо, принимает участие система окислительного фосфорилирования, так как ингибиторы этой системы угнетают их потребление.
Такие первичные аминокислоты, как аланин и глютаминовая кислота, могут накапливаться в мицелии Neurospora crassa в больших количествах (Aurich, 1966), так же как и в уредоспорах.
Puccinia graminis, что может зависеть от отставания процесса их включения в белки по сравнению с их ассимиляцией (Nicholas, 1965). Как единственный источник азота для роста Fusarium оху — sporum лучшими аминокислотами являются аспарагиновая, глютаминовая и Я-аланин, т. е. первичные (Wolf, 1955). Способность использовать их как единственный источник азота может варьировать даже в пределах близких родов. Например, дрожжи из рода Saccharomyces используют как источник азота меньший круг аминокислот, чем дрожжи рода Torula. Амиды соответствующих аминокислот обычно используются лучше, чем они сами. Так, аспарагин является лучшим источником азота, чем аспартат, в частности для Tricholoma imbricatum, Piricularia oryzae, Leptographium sp. и Phycomyces blakesleeanus. Глютамин хорошо утилизируют Tricholoma gambosum и другие базидиомицеты. Аспарагин способствует развитию перитециев у Diaporthe phaseolarum. Нуждаются в органическом азоте для споруляции и некоторые другие виды, например Alternaria poonensis.
Серосодержащие аминокислоты обычно плохие источники азота, даже для нуждающихся в органическом источнике серы в виде метионина видов Allomyces и Phytophthora (Machlis, Craseman, 1956). Худшими, чем аминокислоты, источниками азота являются нуклеиновые кислоты и их производные. Из числа нуклеиновых оснований Fusarium oxysporum лучше используют пурины, чем пиримидины, пиримидиннуклеозиды, чем пиримидиннуклеотиды, и свободные основания. Так, Fusarium oxysporum лучше утилизирует цитидин и уридин, чем цитидиловую и уридиловую кислоты, и РНК лучше, чем ДНК, a Neurospora одкнаково (Wolf, 1955).
Специфичная потребность в определенных аминокислотах встречается у грибов сравнительно редко. Они могут усваивать азот даже из органических нитросоединений, например из нитрированных спиртов, CN — и CNS-групп. Последние группы используют иногда паразитические грибы, если они включаются в состав алкалоидов, свойственных их растениям-хозяевам.
Еще большее влияние, чем на усвоение иоиа NH4+, на усвоение аминокислот оказывают дикарбоновые кислоты. Например, у Phycomyces blakesleeanus на среде с аргинином вес достигал 43 мг, а при добавке в эту среду 0,1% янтарной кислоты—192 мг. Видимо, при этом легче происходит биосинтез набора аминокислот, образующихся в результате реакции переаминирования и участвующих далее в биосинтезе протеинов. Вторая функция дикарбо — новых кислот состоит в нейтрализации получающегося при дезаминировании аминокислот избытка аммиака. Сходная причина, т. е. степень легкости использования в реакциях переаминирования, лежит в основе наблюдавшегося Стейнбергом явления градации степени пригодности аминокислот как единственного источника азота (Steinberg, 1942). Из 22 испытанных им аминокислот наилучшими оказались 7: аланин, аспарагиновая кислота, аргинин, глицин, глютаминовая кислота, пролин и оксипролин, которые были названы первичными. Стейнберг предполагал, что остальные 15 аминокислот, входящие в состав белков, образуются на основе этих семи, что, в общем, соответствует современным представлениям.
Абсолютная специфичная потребность в отдельных аминокислотах у грибов встречается только среди мутантов, а у природных форм главным образом относительная, выражающаяся в улучше — «ии роста в их присутствии. Например, Мисепа rubro-marginata реагирует так на ароматические аминокислоты, тирозин или фенилаланин, Cenococcus graniforme — на гистидин, Eremothecium ashbii—на несколько аминокислот при его росте на среде с кислым pH (Nicholas, 1965). Использование аминокислот грибами может осуществляться путем их прямого включения в белки или путем их дезаминирования и переаминирования (Фостер, 1950; Лилли, Барнетт, 1953/рис. 4.2).
1. Окислительное дезаминирование:
RC*H (NH2) COOH-i^.*-* RC*OCOOH + NH3
Кетокислоти
Пример:
СНзч СН3ч
>СНСН4С*Н (Ш2) СООН снсн2с*осоон + Ш3
СН/ Лейции СН3′ а-Кетоизокапроиовая кислота
С последующим окислительным декарбоксилированием (в общей форме):
і* —;сн (ын2) соон + о2-> ксоон + ын3+со2
2. Гидролитическое дезаминирование:
і* —[с*н (ын2) соон і*с*н (он) соон + ын3
Оксикислоти
3. Дезаминирование с гидролизом н декарбоксилированием:
I* — С*Н (ЫН,) СООН -+ні°- РС*Н2ОН + СОо + ЫН,
Спирт
Пример (получение сивушного масла):
СНз. СН3ч
рСНСНгСН (ЫН2) СООН + НаО ^)СНСН2СНаОН + СО* + ЫН3 СН8′ Лейции СН3′ Изоамиловый спирт
Рис. 4.2. Пути использования аминокислот грибами
Для синтеза белков цитоплазмы очень важен процесс транс — аминирования (или переаминирования), который известен у многих грибов и требует в качестве кофактора пиридоксальфосфата (рис. 4.3).
Глютаминовая кислота, так же как и образующаяся из нее при декарбоксилировании к-аминомасляная, является лучшим донором аминогрупп при переаминировании. Переаминирование с использованием этих субстратов обнаружено у очень многих видов грибов, включающих виды родов Aspergillus, Neurospora и Endo — mycopsis (Nicholas, 1965). Большой ряд последовательных сийте-
RCOCOOH + NH3 +Н2 J?!— RCH (NH2) СООН + НаО Кетокислота Аминокислота
Переаминирование (трансамнннрование):
RCOCOOH + R’CH (NH*) СООН -2i_> RCH (NHa) COOH + R’COCOOH Кетокислота • Аминокислота Аминокислота Кетокислота
Например:
HOOC(CH2)sCO(NH2)COOH + RCOCOOH НООС(СН2)2СОСООН + RCH(NHa) СООН Глютаминовая кислота Кетокислота а-кетоглютаровая Аминокислота
кислота
Рис. 4.3. Схема процессов синтеза аминокислот у грибов и переамииирования
зов аминокислот был изучен на моделях мутантов Neurospora и других грибов.
В последнее время аминокислотный состав плодовых тел и1 культивируемого мицелия грибов привлек большое внимание в связи с использованием их как пищевых и кормовых ресурсов. Прет этом выяснилось, что и те и другие обладают вполне полноценным набором аминокислот, в том числе и незаменимых. Примером этого может служить работа Р. А. Масловой (1978) по анализу аминокислотного состава плодовых тел и культивируемого мицелия ряда грибов-трутовиков, среди которых ею были изучены Тга — metes suaveolens, Cariolus zonatus, Laetiporus sulphureus, Gloeo — phyllum sepiarum, Lenzites betulina и Coltr, icia perennis (табл. 4.5).
Таблица 4.5
|
Аминокислотный состав мицелия грибов-трутовиков, выращенных на среде с пептоном и глюкозой (в % иа сухую массу) (Маслова, 1978)
|
При этом, что особенно важно, у культивируемого мицелия максимум накопления большинства аминокислот, судя по примеру Т. suaveolens, достигался уже на восьмые — девятые сутки роста, что практически вполне приемлемо, хотя и уступает скорости роста специально отобранного для пищевых целей штамма Polyporus squamosus А. К. Торева (1975).
Количество отдельных аминокислот в мицелии среди культур, испытанных Р. А. Масловой, достигало у преобладающих в гидролизате, как аланин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты и лейцин, 4—5% от сухой массы мицелия. Лизина накапливалось порядка 2%- Не хватало в гидролизате культивируемого мицелия только присутствовавшего в гидролизате плодовых тел триптофана (табл. 4.5).
4. Метаболизм и роль мочевины у грибов
Конечным продуктом распада белка у живых организмов могут быть аммиак и диамид угольной кислоты или мочевина, которая занимает в обмене грибов совершенно особое и специфичное место. Иллюстрацией процесса биосинтеза мочевины у грибов служит образование ее из аргинина по следующей схеме:
NHgv
).С— NH (СНа)8 CH—NHaCOOH + Н20 -*.
NH^
Аргинин
-» СО (NHa)a + NHa (СНа)з CH-NH2
СООН
Мочевииг Орнитин
Может она образовываться, например, у дрожжей также из нуклеиновых оснований (рис. 4.4/Di Carlo et al., 1952).
N= CNHa HN—CO HN—CO HN—CO
I I но I I h Ilm 11 /NH*
ОС CH H*° —> ОС CH-ik-OC CHa-SSi— PC CH2 +CO<
I II I II II II nnh2
HN—CH HN—CH HN—CHj HN—CHCOOH
Цитозин Уридин Гидроуридии Гидрооротовая Мочевина
кислота
Рис. 4.4. Образование мочевины у дрожжей из пиримидиновых оснований
У животных мочевина представляет собой конечный продукт распада белка, выключаемый из обмена, тогда как у грибов она имеет совсем другое значение. Мочевина широко распространена у грибов и обильно накапливается в мицелии, особенно у гимено — мицетов в период созревания плодовых тел и особенно в их гиме — нии. Обмен мочевины у грибов подробно изучался в многочислен-
|
Рис. 4.5. Схемы, сравнивающие метаболизм мочевины н запасных аминокислот у животных, фотосинтезирующих растений и грибов |
|
*сукцинат 3/ со2 + 2ГЖ3 Ш |
|
» Аргининосукцинаг мсн(соон)сн2соон нм=снн(сн2),сн(мн2)соон ^ п ^ сукцинит |
|
5 +н2о |
|
н2мсомн(сн2)3ен(мн2)соон |
|
Цитруллин |
|
сн2сн2соон снсоон МНС0Ж2 Н^СООР |
|
Урваза H2N-CO-NH2 ———- / МочеВина / Н2М(СН2)3СН(МН2)С00Н * |
|
Карбамшнросфат |
 |
|
|
|
 |
нооссн2сн2сн (м н2)соон
Глутамат
Рис. 4.6. Схема процесса биосинтеза аргииииа и образования мочевины
ных работах Иванова, относящихся к двадцатым годам нашего века (Иванов, 1928; Иванов и Цветкова, 1936). Особенно большое количество мочевины было им обнаружено в плодовых телах дождевиков: Lycoperdon содержал ее до 10% от сухой массы, Bovi — sia — до 12%, а шампиньоны еще больше. При помещении созревшего плодового тела в атмосферу аммиака количество мочевины в гимении повышалось до 14%. Однако в растворе сахара мочевина исчезала, расщепляясь ферментом уреазой до углекислоты и аммиака, который расходовался затем на синтез аминокислот и протеина, сопровождавшийся ростом плодового тела. Из этого можно было сделать вывод, что мочевина представляет собой у грибов запасное вещество с функцией, аналогичной функции аспарагина и глютамина у высших зеленых растений, у которых количество аспарагина повышается в темноте при отсутствии синтеза углеводов и уменьшается, расходуясь на синтез белка и рост,, при новом поступлении углеводов.
Принципиальные различия в азотном обмене у животных, где мочевина является отбросом, у грибов, где она имеет функции запасного продукта, и у растений, где эту функцию несет аспарагин, приведены на рис. 4.5.
Особое значение мочевина имеет в биосинтезе аминокислот аргининового цикла, входящих в состав гистонов, основных белков, играющих ведущую роль в процессах инициации репликации хроматина и стимуляции или репрессии транскрипции рибонуклеиновых кислот. Обмен в этом цикле идет по схеме рис. 4.6.
Этот цикл обратим на всех его этапах, а подобное направление биосинтеза подтверждено работами с применением мутантов Neu — rospora (Вагнер и Митчелл, 1958).