В связи с дефицитом и ростом потребления белка животного происхождения большое внимание уделяется использованию целлюлозосодержащих субстратов для получения белковой биомассы, при этом предпочтение отдается прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза в белок. В качестве продуцентов целесообразнее использовать мицелиальные грибы, способные синтезировать комплекс гидролитических ферментов, что позволяет микроогранизмам ассимилировать растительные полисахариды без их предварительного расщепления.
Вопрос о микробиологической и ферментативной деградации целлюлозы обсуждался на симпозиуме по этой проблеме, проходившем в 1976 г. в Берлине. Nolan, Forro (1976) предпочтение отдали выращиванию на лигноцел — люлозных субстратах актиномицетов, утилизирующих целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал. Максимальная клеточная масса их накапливалась к 24 ч культивирования. Усваивалось 70% целлюлозы. Содержание протеина в биомассе составляло 40%. Исследуя рост термофильного актиномицета на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии целлобиозу, набухшую целлюлозу и микрокристаллическую целлюлозу, Su Tah-Mun, Paulavicius (1976) установили, что рост актиномицета на цел — лобиозе и набухшей целлюлозе происходит экспоненциально до полного исчерпания субстрата. Рост же на микрокристаллической целлюлозе происходит в две фазы. В первой фазе культура растет экспоненциально, но с меньшей удельной скоростью, чем на целло — биозе и набухшей целлюлозе. При этом потребляется 50% микрокристаллической целлюлозы (МЦ). Во второй фазе культура гидро — лизует МЦ, но рост прекращается. Скорость потребления МЦ значительно ниже, чем скорость потребления целлобиозы или набухшей целлюлозы. Оптимум рН и температура для ферментативного гидролиза целлюлозы и роста актиномицета разные (6,2 и 60 °С и 7,5 и 55° соответственно). С целью увеличения выхода биомассы, по мнению авторов, необходимо уменьшение значения рН в конце первой фазы роста.
Tuse, Msich (1976) наиболее целесообразным считают проведение предварительной Щелочной делигнификации субстрата, затем осахаривание его коммерческим ферментом, получаемым из гриба Trichoderma viride, и, наконец, выращивание на растворимой фракции Candida utilis.
Занимаясь микробиологической трансформацией целлюлозы в бело к, Srinivasan (1978) исследовал два типа ферментации: ферментацию бактериями p. Cellulomotias и нестерильную ферментацию целлюлозы микроскопическими грибами, в частности неидентифициро — ванным до вида штаммом p. Aspergillus. Ферментация проводилась при рН 3,5. По мнению авторов, перспективным является отбор мутантов, обладающих наряду с целлю — лазной активностью способностью синтезировать повышенные концентрации лизина, что улучщает ценность белкового препарата.
Abed et al. (1978) при получении белковых веществ из отходов сельского хозяйства и промышленности предпочтение отдают смешанному выращиванию Trichoderma viride и Candida utilis. Содержание белка биомассы при ассоциативном культивировании составляло 40%, в то время как при выращивании монокультуры С. utilis только 34%. Целлюлазная активность гриба отмечена в широком диапазоне рН — от 4,0 до 8,0 с оптимумом рН 6,0.
Stanton (1978) и. Schemmp (1978) отмечают, что мицелиальные грибы по своим показателям (скорость роста, содержание белка и т. д.) не уступают другим продуцентам белка. Так, по данным Solomons (1972), максимальная скорость роста грибов может достигать 0,4 ч-1, время удвоения биомассы —1,7 ч. Наивысшее содержание азота — И,8%, сырого протеина — 74%, истинный белок достигает 50%. Из проверенных Solomons свыше 100 ми — целиальных грибов только один оказался токсичным. Сумма аминокислот в белке лучшего продуцента составляла 45%. Отмечено высокое количество в биомассе лизина и триптофана.
Многие авторы (Macris, Kokke, 1978, 1979) считают более перспективным выращивание грибов для получения белка непрерывным способом. Культивирование гриба Fusariutu то — niliforme при различных скоростях роста позволило установить, что при увеличении скорости роста повышается содержание в мицелии углеводов и пуринов, в то же время идет снижение «сырого» протеина и истинного белка. При [Л = 0Д14 Ч"1 сырой протеин в мицелии составлял 47,9%, истинный белок — 36,3%. Непрерывный процесс, по мнению исследователей, целесообразно проводить при ja = 0,205 ч-1. Определение индекса Озера (индекс незаменимых аминокислот — ЕАА-индекс) показало, что максимальных величин ЕАА-индекс (79,1) достигал при |і = 0,114, минималь- . ных — 60,6 при (х = 0,124. ЕАА-индекс дрожжей составляет 80,1, говядины — 87, картофеля — 71, кукурузы — 70, соевой муки — 85, пшеницы — 67, яйца — 100.
В качестве субстратов для выращивания мицелиальных грибов может быть использовано различное целлюлозосодержащее сырье, в том числе и солома злаковых культур, содержащая до 75% полисахаридов в форме целлюлозы и гемицеллюлозы, а также 15— 17% лигнина. Последний затрудняет утилизацию целлюлозы. Для повышения доступности ее предварительно измельчают и обрабатывают щелочью либо кислотой. На полученном субстрате культивируют микроскопические ‘ грибы. Так, например, используется Т. viride, способный синтезировать довольно большое количество внеклеточных целлюлолитических ферментов. Для ускорения роста грибов вносят 0,05% глюкозы и 0,01% пептона (Spano, 1976; Cysewski, Wilke, 1976; Peitersen, 1975). В процессе роста гриб синтезирует целлюла — зы, расщепляющие полисахариды соломы,
Следствием чего является образование целло — биозы, глюкозы и ксилозы. В лабораторных условиях из 8 кг соломы получают 1 кг белка. Готовый продукт содержит 21—24% протеина, в котором 80% составляют аминокислоты, в том числе 4,4 г лизина, 1,5 г цистина, 1,4 г метионина на 16 г азота. На основании опытов по скармливанию белка крысам была вычислена его переваримость и биологическая ценность. Если дополнить белок из соломы казеином (50% от азота в смеси) и dl-метиони — ном (0,5%), то биологическая ценность увеличивалась до 84 и перевариваемость до 75% (вместо 66 и 67% соответственно).
Romanelli et al. (1975) подобраны оптимальные условия ферментации целлюлозы трех термофильных грибов — Chaetomium thermophile QM-9381, Sporotrichum therniop — hile-9382, Thermoascens aurantiacus-9383, обладающих выраженной целлюлолитической активностью. На среде с 1% целлюлозы гриб S. thermophile за 3 дня инкубации расщеплял 56% вносимой целлюлозы, образуя 0,3 г биомассы на грамм используемого субстрата. Содержание белка в биомассе составляло 40%. Аналогичная работа проведена Ramoentchuk (1975), Mc-Lennan (1974), Kazuo (1975), Ralph (1976) по получению кормового белка на основе отходов производства бумажной массы с помощью гриба Paecilomyces varioti. Грибная биомасса содержала 55—60% белка и не оказывала токсического действия на животных.
Исследование продуцирующей по белку способности грибов родов Cladosporium, Al — ternaria, Aspergillus позволило выявить наиболее перспективные штаммы (p. Cladospori — ит и Alternaria), которые при росте на соломе увеличивали содержание протеина в 1,5—8 раз (Старченко, Капуста, 1975). При подтверждении отсутствия токсического их действия на животных возможно использование биомассы этих грибов на соломе как дополнительный источник белка. Kremar (1975) в качестве продуцентов белка использовал культуры грибов Aspergillus, Penicillium, Tricho — derma, Chaetomium, а в качестве источника углерода — солому, тростниковую мелассу, отходы бумаги. Sitaram et al. (1978) исследовали 5 штаммов Asp. niger, один штамм Penicillium chrysogenum и Pestalotia sp. и установили, что лучщим продуцентом белка при выращивании на среде с рисовой соломой, скорлупой арахиса или багассе является гриб P. chrysogenum St-F-ЗВ. При выращивании его на среде с рисовой соломой в течение 72 ч выход белка составил 85 мг/г сухого субстрата, содержание белка в биомассе достигало
41%.
Geathadevi et al. (1978) был проведен скрининг грибов по способности синтезировать на соломе белковую биомассу и целлюлазу. Изучались преимущественно грибы родов pergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma и Trametes. Содержание протеина в биомассе грибов Asr. flavus (4 штамма) составляло 16—24%, Asp, niger (8 штаммов) — 7,5— 25,8%, Asp. terreus (2 штамма) — 22—41%, Р — chrysogenum (3 штамма) — 13—40,5%. Лучшими продуцентами белка оказались р■ chrysogenum и Tr. viride.
Moo-Young et al. (1979) разработали процесс получения белка (Батерлу) из сельскохозяйственных и лесных отходов. Из отходов сельского хозяйства предпочтение отдается соломе злаковых культур, кукурузной кочерыжке, багассе, а также отходам животноводческих ферм (навоз), из лесных отходов — древесным опилкам, пульпе. Процесс Ватер — лу испытан в 200- и 1000-литровых ферментерах. Он предполагает 3 ступени: химическую или термическую обработку целлюлозосодержащих материалов; аэробную ферментацию; отделение продукта от культуральной жидкости. В среду наряду с субстратом (целлюлоза) вносят азот, калий, фосфор (NPK), однако вносят не в виде солей, а в форме навоза либо коммерческих смесей. Навоз подвергается анаэробной ферментации. Образующийся при этом метан может использоваться в качестве источника энергии для проведения химической либо термической обработки субстрата, а также для осуществления самого процесса получения белка. Продукт хорошо переварим, не токсичен, может быть применен в качестве кормовой дооавки вместо рыбной и соевой муки, которые в свою очередь можно высвободить для нужд человека.
В табл. 4, 5 представлены данные о составе и аминокислотном профиле грибного белка Ватерлу в сравнении с другими белковыми препаратами. Биологическая ценность получаемой биомассы апробирована на крысах, цыплятах и овцах. Продукт имеет серый цвет, гранулированную структуру, грибной запах, влажность 8%, перевариваемость (на крысах) 73%, содержит 4% целлюлозы, 12% лигнина, 12% золы. По составу и количеству важней — шйх компонентов грибной белок Ватерлу ближе к мясному, а не к соевому, содержит меньше, чем дрожжи, нуклеиновых кислот и больше серусодержащих аминокислот. Авторы считают его производство экономически целесообразным. Производство продукта Ватерлу и его использование возможно как в развитых, так и в развивающихся странах.
|
Таблица 4 Сравнительная характеристика грибной биомассы Ватерлу, % (Moo-Young et al., 1979)
|
Таблица 5 Сравнительное содержание аминокислот в грибном белке Ватерлу, % (Moo-Young et al., 1979)
Аминокислота
Ізолейцин
Лейцин
Лизин
Метионин+цистин
Фенилалаиин
Іреонин
Триптофан
Тирозин
Валин
|
Норма ФАО |
Соевая мука. |
WAT-белок |
Дрож жи |
|
4,2 |
4,2 |
4,7 |
5,3 |
|
4,8 |
7,7 |
7,5 |
7,0 |
|
4,2 |
6,4 |
6,8 |
6,7 |
|
4,2 |
2,2 |
2,6 |
1,9 |
|
2,8 |
4,7 |
3,8 |
4,3 |
|
2,6 |
3,6 |
6,1 |
5,5 |
|
1,4 |
1,7 |
Не опре д. |
1,2 |
|
2,8 |
2,7 |
3,3 |
3,3 |
|
4,2 |
4,4 |
5,8 |
6,3 |
Из обследованных свыше 500 образцов почв, компостов этими же авторами выделено 5 культур грибов, способных расти на среде, содержащей целлюлозу как единственный источник углерода, и накапливать значительную биомассу не более чем за 3 суток. Среди них два штамма отнесены к роду Aspergillus, два — к роду Trichoderma, один не был идентифицирован. Наиболее активным при росте на средах с 4 различными видами целлюлозы (разлагает 80% целлюлозы, предварительно обработанной щелочью), а также по сравнительно высокому накоплению биомассы. (2,2 г белка на 200 г целлюлозы в день) оказался штамм Aspergillus sp. № 81 (Yusaku, Moo — Young, 1980).
Интересна работа по биоконверсии целлюлозы пшеничной соломы и ее компонентов в белок. Пшеничная солома состоит из ~40% целлюлозы, 13,6% лигнина, который связан с гемицеллюлозой и целлюлозой. Таким образом, нативные лигноцеллюлозные материалы требуют предварительной обработки. Однако, как считают Chahal et al. (1979), при химической предобработке теряется значительная часть гемицеллюлозы и лигнина. Например, Dunlap (1975) обнаружил, что щелочная обработка (0,2—0,3 г NaOH/r субстрата) удаляет около 50% его сухой массы, что связано главным образом с растворимостью гемицеллюлозы (ГЦ) и лигнина—потенциальных субстратов для получения белка. Аналогичные результаты получены Ramasamy et al. (1979)- По их данным, из-за растворения ГЦ и лигнина потери в массе субстрата составляют 18— 53%. С целью избежания указанных потерь для удаления лигнина предлагается (Chahal et al., 1979) обрабатывать солому пшеницы хлористым натрием. При этом не затрагиваются ГЦ и целлюлозные компоненты соломы.
Проведена также большая работа по культивированию целлюлолитических грибов как на цельной соломе, так и на ее компонентах с целью оценки потенциальных возможностей для получения белка как грибов, так и самих субстратов. Использованы грибы Asp. niger, Asp. terreus, Cochliobolus sp., Myrothecium verrucaria, Rhizoctonia solani, Spicaria fusis — pora, Penicillium sp., Gliocladium sp., выделенные из разлагающейся пшеничной соломы. Самым эффективным продуцентом белка, по мнению Chahal et al. (1979), оказался гриб Cochliobolus sp. Оба Aspergillus и Penicillium sp. были относительно слабыми продуцентами протеина, a Rhizoctonia solani — самым неэффективным в отношении превращения субстратов в протеин. Максимальное образование белка (186 мг/г субстрата) получено после 4 дней культивирования гриба на делигнифици — рованном субстрате (холоцеллюлозе). При Удалении из субстрата гемицеллюлозы выращивание гриба сократилось до 3 суток. Резюмируя изложенное, следует отметить, что Cochliobolus обладает способностью к росту на всех 3 субстратах. Самое высокое содержание (43,3%) и самое высокое количество протеина (220 мг/г субстрата) было получено на Целлюлозе; на холоцеллюлозе образование протеина составляет 204 мг, на соломе—110 на 1 г используемого субстрата. Но ситуация несколько меняется, если сравнить образование протеина на единицу исходного субстрата. Количество его снизилось до 92,4 мг/г субстрата (при выращивании на целлюлозе) из-за потери гемицеллюлозы в исходном субстрате.
Таким образом, любая делигнифицирую — щая обработка целлюлозных материалов, сопровождающаяся удалением ГЦ, дает очень низкий выход протеина на единицу исходного субстрата. Авторы делают вывод, что лигнин мешает утилизации целлюлозы и других компонентов соломы грибов Cochliobolus sp. Невысокая продуктивность его на холоцеллюло — зе может быть следствием присутствия некоторых сахаров (арабинозы, галактозы), которые плохо утилизируются многими грибами. Более того, некоторые остатки Сахаров являются метилированными, что, возможно, повышает стойкость субстрата к действию ферментов. По мнению Chahal et al. (1979), де — лигнифицирование лигноцеллюлозных материалов хлористым натрием целесообразно для увеличения образования протеина. Однако широкое использование этого способа несколько сдерживается из-за его малой экономичности ввиду высокой стоимости реактивов. Возможна также мягкая обработка соломы низкими концентрациями NaCl или другими недорогими окисляющими агентами, такими, как SO2; последний может разрушать лигнин, не затрагивая другие компоненты. Аналогичный эффект дает делигнификация сельскохозяйственных отходов 1%-ным NaOH при условии, когда жидкость, содержащая растворенный лигнин и ГЦ, удерживается вместе с целлюлозой в среде.
Большая исследовательская работа по получению кормовых белков путем культивирования мицелиальных грибов на сельскохозяйственных отходах проводится в Индии (Jauhri et al., 1978). Изучена способность различных грибов — Macrophomina phaseoli, Polystictus xanthopus, Rhizopus, arrhizus, Asp. flavus, Tr. viride, Mucor mucedo, Rhizoctonia melongina, Polystictus affinis, Coprinus aratus, Pleurotus, melongina — обогащать белками пшеничную солому и навоз крупного рогатого скота. При приготовлении питательной среды вносится декстроза в качестве стартового источника углерода в количестве 1 г/л. Наилучщие показатели для культуры Rhizoctonia melongina получены при 10-дневном культивировании. Выращивание можно вести в интервале температур от 10 до 45 °С. Максимальная продуктивность по белку для одного штамма R. melongina наблюдалась при 35°, а для Pleurotus ostreatus — при 27°. Уточнены также оптимальные значения рН среды, составившие для Я. melongina 5,0, а для Coprinus aratus 7,0. Показано, что белок полученных биомасс не равноценен по качественному составу. Так, в белке R. melongina отсутствует лизин, находящийся в больших количествах в белках ДРугих микроорганизмов.
Интересные сообщения о микробиологической трансформации сельскохозяйственных отходов были сделаны на Международном симпозиуме, проходившем в 1980 г. в Индии. По данным Sahm, Santo (1980), лучшим продуцентом белка на среде с соломой, обработанной аммиаком, оказался гриб Humicola tuscoatra. На 3—4-е сутки его культивирования в биомассе содержится до 15% протеи-
4- Зак. 1108 до на. Я. fuscoatra способен утилизировать и ксилан, таким образом, из 1 кг сухой соломы возможно получить 1,25 кг съедобных грибов. При использовании гриба Chaetomium cellulolyticum в процессе твердофазной ферментации содержание протеина в конечном продукте составляло 10, 20% соответственно для необработанной и обработанной щелочью соломы (Chahal et al., 1980).
Проблемой микробиологического превращения растительной биомассы и ее отходов б белок, этанол или метан интенсивно занимаются в Институте биотехнологии ГДР Sahm, Schoberth (1979). Из различных почвенных образцов они выделили около 500 штаммов бактерий и грибов, способных использовать лигнин, целлюлозу или гемицел — люлозу в качестве единственного источника углерода и энергии. Для энзиматического расщепления целлюлозы до глюкозы авторы берут определенные штаммы гриба Tricho — derma и его мутанты. Поиск микроорганизмов с высокой ксиланрасщепляющей ферментативной активностью позволил выделить ряд видов грибов и бактерий, в частности Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Penicil — lium, Trichoderma.
Большой интерес в качестве сырья для ферментации представляют стержни початков кукурузы, жмых, виноградные и плодово-ягодные выжимки, отходы консервной и сахарной промышленности, содержание белка в которых очень низкое. В этом случае мицелиальные грибы, используемые в качестве продуцентов белка, должны отвечать следующим требованиям: аминокислотный состав продуцируемых ими белков должен быть близок к соевым, количество белка не ниже 40% массы сухого мицелия, биомасса нетоксичной (Dardenne et al., 1975). В качестве продуцентов рекомендуются Penicillium Р45, Fusarium Р56, Fusarium moniliforme, Aspergillus, Actinomyces, Tr. viride, Chaetomium globosum, Myrothecium verrucaria. Из грибов рода Aspergillus наивысшим выходом белка на единицу твердого субстрата обладал гриб Asp. fumigatus.
Большую работу по повышению кормовой ценности кукурузных стержней провели украинские исследователи (Богдан, Сивере, 1979). В нативные и осахаренные частичным кислотным гидролизом субстраты вносилась взвесь конидий гриба Geotrichum candidum. Выращивание осуществлялось при 22—25 °С в течение 5 суток. В продукте (обогащенные стержни) значительно уменьшалось количество лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы при одновременном увеличении содержания Сахаров, органических кислот и белка.
Geotrichum candidum также используют Для получения белков путем ферментации — жмыха, рапса, сои, арахиса и других культур (Staron, 1976). Как известно, в жмыхах из семян некоторых растений (редьки, арахиса, сои, подсолнечника, кунжута, клещевины, хлопчатника и др.) иногда содержатся токсические вещества (афлотоксины, изоти- Цианаты и др.), что не позволяет использовать жмыхи в нативном виде в качестве кормовых добавок Для детоксикации и повышения питательной ценности жмыхов их используют как субстрат для выращивания гриба. Йз полученной биомассы выделяют полноценный белок. Для получения белка путем ферментации из стручков белой акации берут грибы Tr. viride и Asp. tiiger, при этом первый расщепляет субстрат, второй же использует образовавшиеся углеводы для синтеза биомассы. Как известно, во Франции предложен способ получения препаратов кормовых белков ферментацией растительных жмыхов с использованием культур родов /4s — pergillus, Rhizopus. В Японии для этих целей применяют гриб p. Rhizopus, в Дании — Tr. viride. Для обогащения отходов сахарного производства — отжатый сахарный тростник — применяют гриб Tr. lotigibrachiatum. Наиболее подходящим субстратом для получения белка из этого субстрата оказалась холоцеллюлоза, полученная путем делигни — фикации хлористым натрием тростника (Sid — hu, Sandhu, 1980).
В Грузии (Микеладзе и др., 1980) разработана технология получения аминокислот из диффузионных соков сладких виноградных и плодово-ягодных выжимок, остающихся в виде отходов при производстве соков и вин, белково-ферментного комплекса, содержащего 70—75% белка с высокой целлюлолитической активностью, а также технология производства сухого биошрота с содержанием белка 15—16%. Технология производства заключается в выращивании плесневых грибов Fusa — rium samitectum и Sporotrichum polverulen — tum поверхностным методом. Организация производства биошрота и белково-ферментного комплекса в Грузии может дать экономический эффект более 15 млн. руб. в год.
Naomichi, Shiro (1979) исследовали способность 39 культур микроскопических грибов родов Aspergillus, Podospora, Sordaria, Chaetomium и др. мацерировать кожуру мандарин, что позволило установить наибольшую активность у гриба Asp. niger, при действии которого за 24 ч мацерации из 1 г кожуры образовывалось 0,57 г редуцирующих веществ, которые затем могли быть использованы для целей микробиологического синтеза.
Для получения белковых веществ используются различные отходы консервной промышленности, образующиеся, например, при переработке листьев капусты и шпината в пищевой продукт, называемый СЭГ. Перед консервированием СЭГ мацерируют, варят и пропускают через сито. Фракция, не прошедшая через сито, сушится при 60 °С, размалывается и используется в качестве субстрата для культивирования термотолерантных грибов Actinomucor sp. и Chaetomium cellulolyticum либо в нативном виде, либо после частичной делигнификации.
В последнее время появляется много сообщений об использовании для выращивания микроорганизмов отходов деревообрабатывающей промышленности, в частности опилок. В Англии (Moo-Young et al., 1977, 1978) получен новый термотолерантный гриб Chaetomium cellulolyticum — потенциальный продуцент кормового белка. Выращивание его на частично делигнифицированных опилках в качестве единственного источника углерода Доказало, что С. cellulolyticum растет в 1,5— раза быстрее и образовывает в 1,8 раза больше белка биомассы, чем хорошо известный продуцент целлюлаз целлюлолитический гриб Tr. viride. На среде с опилками С. cellu — lolyticum и Tr. viride образуют соответственно 1,8 и 1,3 г/л белка. Грибная биомасса содержала 40,0 и 25,4% протеина. Белок биомассы С. cellulolyticum по аминокислотному составу лучше белка Tr. viride и близок к белку, рекомендуемому ФАО для питания человека. Выращивание гриба следует вести при поддержании рН среды 5,0.
Изучение ферментации различных растительных отходов (опилки бука, солома тростника, стебли подсолнечника, отходы капусты, рисовая шелуха) в корм с помощью базидио — мицетов позволило выявить грибы Pleuro — tus sp. Florida и Stropbaria rugosoannulata, которые активно разлагают лигнин и повышают перевариваемость всех субстратов, за исключением рисовой шелухи (Zadrazil, 1980).
Pamment et al. (1979) отмечают потенциальное преимущество ферментации опилок. При поверхностной ферментации в этом случае конечный продукт содержит столько же протеина, сколько и при глубинном выращивании. Недостатком описанного поверхностного культивирования является более высокое содержание спор в биомассе. Однако спо — руляцию возможно снизить путем установления оптимальных условий влажности, перемешивания и скорости подачи питательных веществ. Время ферментации при поверхностном культивировании составляет 9—20 дней, при глубинном — 3—5 суток. В конечном продукте содержится 7,6—11,2% (поверхностное выращивание) и 7,8—12,0% протеина (глубинное выращивание). Средняя удельная скорость роста культуры равна соответственно 0,004—0,01 и 0,01—0,03 ч-1. Результаты исследований дают представление о том, что процессы ферментации в твердой фазе в техническом и экономическом плане могут конкурировать с глубинными процессами получения белка из лигноцеллюлозных субстратов, особенно если рассматривать вопрос с точки зрения снижения стоимости продукта. Изучая возможность использования отходов бумажных производств для культивирования Chaetomium cellulolyticum, Pamment et al. (1979) получали препарат, содержащий до 28% протеина. В качестве субстрата для роста использовали отходы, образующиеся на различных стадиях производства и при различных технологических схемах.
Разложением лигнина под действием де- реворазрушающего гриба Phanerochaete занимаются и в лаборатории лесных продуктов Мэдисонского университета в США (Kirk, 1978). Здесь предпочтение отдается также выращиванию грибов в поверхностной культуре. Оптимум рН для роста культуры 4,0— 4,5. Повышение либо понижение значений рН приводит к сильному замедлению процесса.
Скрининг 30 культур актиномицетов, проведенный в университете США (Айдахо), позволил отобрать 3 штамма, способных разлагать лигноцеллюлозу (Crawford, 1978). г — Совместное исследование сотрудниками Университета им. Марии Кюри-Складовской (Польша) и Института почвенной биохимии в Брауншвейге (ФРГ) позволило выделить из почвы штамм Nocardia, способный разлагать лигнин и использовать его мономеры. Выделенная культура разлагает лигнин более активно, чем известные ранее грибные штаммы (Gradziel et al., 1978).
Migliett, Marcipar (1977) разработали способ ферментации рисовых отрубей культурой Asp. oryzae. Авторами определен материальный баланс процесса и показана перспективность использования этого продукта при кормлении домашней птицы.
На состоявшемся в Риге в 1980 г. координационном совещании по программе «Трансформация продуктов фотосинтеза» указывалось на необходимость разработки основ направленного превращения растительного сырья в более ценные пищевые и кормовые ресурсы, создания рациональной технологии получения белковых и углеводных продуктов из местного сельскохозяйственного сырья. Здесь также указывалось на перспективность процессов сухой ферментации на крахмал — и целлюло — зосодержащих субстратах.
Несколько позже в Риге проходил Всесоюзный семинар «Превращение древесины при микробиологическом и энзиматическом воздействиях», на котором освещались вопросы изменения химического состава различных видов древесины и соломы при действии грибов как в естественных условиях, так и при искусственном их выращивании с целью получения кормового белка. Особое внимание уделялось предварительной обработке, способствующей ферментативному гидролизу полисахаридов древесины и соломы зерновых культур. В сообщениях ряда авторов (Вие — стурс и др., 1980) рассматривалась микробиологическая трансформация соломы и некоторых других содержащйх целлюлозу отходов в белковый препарат культурами рода Trichoderma. Указывалось, что микробная биомасса, полученная на субстрате, содержащем термохимически обработанную солому, пшеничные отруби и коричневый сок люцерны, накапливала около 20% белка. Авторами разработана лабораторная технология и аппаратура для глубинного и поверхностного культивирования грибов.
Советско-американская конференция по промышленной микробиологии также вызвала большой интерес ученых к проблеме переработки сельскохозяйственных и промышленных отходов (сыроварения, целлюлозобу — мажного производства и навоза) в кормовые продукты или энергетическое сырье. Имеются указания на потенциальные возможности использования для этих целей навоза животных. Так, в Великобритании для обогащения навоза свиней белком используется гриб Aspergillus niger Ml. Выращивание его проводится в 10-литровом ферментере. Для приготовления культуральной среды жидкие отходы разбавляют и добавляют к ним 3% сахарозы. На этой среде гриб хорошо растет как в периодической, так и непрерывной культуре.
Полученный продукт содержит до 20% белка, его можно вводить в рацион свиней в сыром виде. Свиной навоз, как известно, содержит также крахмал и продукты расщепления целлюлозы, большое количество азота (главным образом в виде мочевины), фос — Ф°Р, калий, другие минеральные элементы и Микроэлементы. После разбавления и добавления углеводов этот отход может быть использован для выращивания гриба Aspergillus niger (Reddington, Brown, 1978). Для ферментации навоза используют и другие грибы: p. Mucor, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Geotrichum, Endomycopsis, а также дрожжи p. Candida. Разработка технологических методов переработки и утилизации отходов животноводства даст возможность, помимо защиты окружающей среды от загрязнения, создать дополнительные источники кормового белка. і
При отборе микроскопических грибов — продуцентов белка на соломе нами (Бабицкая и др., 1979) использовалась измельченная солома нативная и обработанная 1%-ной щелочью. Для исследований были взяты куль» туры микроскопических грибов, полученные из музея Института микробиологии АН БССР, а также выделенные из почвы. Критерием их оценки служили урожай биомассы, содержание в ней протеина, активность Сж-фер — мента — целлюлазы.
Скрининг свыше 250 культур грибов показал лучшие результаты при ферментации соломы, подвергнутой мягкой щелочной обработке. При выращивании мицелиальных грибов на нативной соломе урожай биомассы лучших продуцентов достигал 10,0 г/л (при внесении 1,5% субстрата). Однако в конечном продукте содержалось значительное количество неусвоенного субстрата, что приводило к снижению образования сырого протеина. Целлюлолитическая активность была также невелика. Было показано’, что более эффективно использовать частично делигнй — фицированную солому. В получаемом продукте при культивировании многих грибов остается лишь незначительное количество неусвоенного субстрата. Урожай биомассы составляет 5—10 г/л с содержанием протеина до 40%.
Наибольшей продуцирующей по белку или биомассе способностью при ферментации обработанной щелочью соломы обладали грибы Т. lignorum, koningii, P. notatum X, P. ver — ruculosum и др. Среди базидиальных грибов лучшими продуцентами белка оказались Partus tigrinus и Pleurotus ostreatus.
С целью повышения урожая биомассы и содержания в ней протеина для лучших продуцентов белка грибов Т. lignorum, koningii, P. verruculosum, P. notalum X оптимизирован состав питательных сред, в частности уточнены источники азотного, фосфорного питания, количество источника углерода. Более рационально внесение в среду 1,5% субстрата. Значительному улучшению результатов способствует внесение в питательную среду глюкозы в количестве 0,1—0,3% и кукурузного экстракта 0,2%.
В связи с тем что 16—30% массы соломы составляет лигнин, для лучшего усвоения ее проводили предварительную обработку субстрата перекисью водорода в концентрации 0,5— ^>0% , растворами аммиака и щелочи (0,5— ®>0%). Для опытов брали солому ржи, которую измельчали, обрабатывали разными концентрациями NaOH (в некоторых случаях еще п°Двергали тепловой обработке), отфильтро — ВЬ1вали и сушили. Лучшие результаты получены при использовании для обработки соломы 1 и 5%-ной щелочи. Урожай биомассы составлял 7—13 г/л, сырой протеин—23—39% и истинный белок— 18—34%.
Однако химическая обработка субстрата удаляет гемицеллюлозу и лигнин. В наших опытах обработка соломы 1%-ным NaOH также приводила к потере массы субстрата, которая составила ~30%. Во избежание указанных потерь и более полного использования субстрата мы остановились на следующем варианте: солому обрабатывают щелочью (0,5—5,0%) соответствующей концентрации из расчета 10 л/кг субстрата; после обработ — — ки смесь нейтрализуют и применяют для приготовления питательных сред. Ферментация модифицированных субстратов культурами P. verrucutosum, P. notatum X и Т. lig- погит 40 показала, что такая обработка более приемлема при получении грибного белка из соломы, сырой протеин достигал 40%, а истинный белок—’34%.
В табл. 6 приведен аминокислотный профиль белков биомасс, полученных при выращивании микроскопических грибов на модифицированной соломе в колбах на качалке в сравнении с исходным субстратом — соломой. Из таблицы следует, что по сумме аминокислот грибные биомассы значительно превосходят субстрат. Если в последнем сумма аминокислот составляет 2,76%, то в биомассах грибов—13—25% (род Trichoderma), 17—22% (род Penicillium). Значительно увеличивается и содержание лизина, серина, пролина, глицина. Биомассы грибов Т. ligno — rum, koningii, P. notatum X, P. verruculosutn отличаются большим содержанием цистина,
|
Таблица б Аминокислотный состав белковых биомасс, полученных при выращивании грибов в колбах на качалке
|
А биомасса Т. lignorum 40 — метионина. Такой аминокислотный профиль наблюдается при выращивании грибов на среде с соломой (15 г/л) и глюкозой (0,05 г/л). Предваритель — ные опыты показали, что увеличение глюкозы До 0,1—0,3% ведет к улучшению аминокислотного состава грибных биомасс.
Рост и образование белковой биомассы На соломе сопровождается синтезом целлю — лолитических ферментов. Из проверенных культур наибольшей целлюлолитической активностью обладали грибы рода Trichoderma. Максимальная активность ферментов отмечена к 84—96 ч, синтез целлюлаз связан с расщеплением субстрата. При этом целлюло — литическая активность большинства грибов гораздо выше при использовании нативной соломы. Исключение составляет P. verruculo — surn. Между подщелачиванием среды в процессе роста грибов и выделением в нее цел — люлолитических ферментов имеется корреляционная зависимость. Следует отметить, что все испытанные грибы выделяют в куль- туральную жидкость мало целлюлазы, активной по отношению к хлопку, и значительное количество целлюлазы, активной по отношению к целлюлозе. Низкое содержание в куль — туральной жидкости целлюлазы, активной по отношению к нативной целлюлозе, по-видимому, связано с сорбцией фермента на остатках субстрата.
Отобранные нами грибы — продуценты белка — выращивались в ферментерах полезной емкостью 30 л (Бабицкая, Стахеев, Костина). Из 600 г соломы было получено 200— 300 г обогащенного биомассой грибов субстрата. Внесение 0,1—0,3% глюкозы способствует повышению в среде редуцирующих веществ, активирует рост грибов, а следовательно, и повышает урожай биомассы (до 500 г из 600 г соломьіі). Биохимические показатели биомасс, полученных при выращивании в ферментерах на синтетической среде и среде с соломой гриба P. verruculosutn, приведены в табл. 7, 8.
Интенсивность аэрации способствует сокращению сроков культивирования (с 96 ч в
|
Таблица 7
|
|
Состав белковых биомасс, % |
|
Таблица 8 Аминокислотный состав белковых биомасс, полученных при выращивании гриба P. verruculosum в 30-литровом ферментере
|
Колбах до 40—48 ч в ферментерах). Сопоставляя данные о составе биомасс, полученных при выращивании P. verruculosum в колбах на качалке и в ферментере, можно сказать, что биохимические показатели их практически одинаковы.
Ферментацию соломы культурой гриба P. verruculosum проводили также в ферментере емкостью 16 м3 (полезный объем 9 м3). В качестве посевного материала использовали инокулюм, выращенный в 600-литровом ферментере на среде Чапека. Количество посевного материала 1%. Из 150 кг соломы получено 100 кг грибной биомассы. Продукт содержит 28% протеина, 20% истинного белка. Клетчатка в биомассе составляет 32%, лигнин 14%. За счет микробной конверсии соломы количество белка в ней возросло в 3,5 раза. Частичная делигнификация соломы и 40- часовой глубинный рост гриба способствуют не только обогащению субстрата протеином, но и уменьшению в нем в 1,06 раза целлюлозы, в 2 раза лигнина. Биологическая ценность белка также высокая — 60, 74%. В на — тивной соломе практически отсутствуют витамины. Обогащенная за счет выращивания гриба солома содержит рибофлавин, никотиновую кислоту, смесь линолевой и линолено — вой кислот, в составе жира — витамин F.
Результаты показывают перспективность применения микроскопических грибов для обогащения целлюлозосодержащих субстратов белком.