Гидролазы

Гидролазами называют ферменты, катализирующие расщепле­ние субстрата на его компоненты с присоединением к ним воды, и у грибов это часто бывают экзоферменты, выделяющиеся в окру­жающую среду. В их число входят карбогидразы, расщепляющие белки и пептиды, различные олиго — и полисахариды, протеолити-
ческие ферменты, расщепляющие белки и пептиды, к которым при­мыкают кератинолитические, разрушающие кератин рога, шерсти и перьев, фибринолитические, гидролизующие фибрин крови, а также расщепляющие фосфорные и другие сложноэфирные свя­зи эстеразы, среди которых различают гидролизующие жиры ли­пазы, фосфолипазы и рассмотренные выше фосфатазы.

Липазы и фосфолипазы[6]. Липазы относятся к числу гидролити­ческих ферментов из категории эстераз, расщепляющих жиры, ко­торыми весьма богаты многие грибы, использующие жиры как источник углерода. Липазы обильно встречаются у многих почвен­ных, плесневых и паразитных грибов.

Реакция, производимая грибными липазами, большей частью состоит в отщеплении от глицеридов жирных кислот, находящихся в положении С-1 или С-3 атомов глицерина (табл. 6.7) в после­довательном порядке от С-3 к С-1 ацильным группам.

Т а б л и ц а 6.7

Катализируемая грибной липазой деградация триацилглицерида (Veete, 1980)]

1,2,3-триацил глицерид 1,2-диацил глицерид + жирная кислота 2-моноацилглицерид + жирная кислота глицерин + жирная’кислота

Для отщепления последней ацильной группы в положении С-2 необходима изомеризация, переводящая ее в положение С-1 или С-3. Это осуществляется грибами, поскольку они почти всегда способны к полному деацилированию триглицеридов. Однако у не­которых форм, например у Aspergillus flavus, такой позиционной специфичности нет, а у Geotrichum candidum специфичность про­является в приуроченности к ненасыщенным жирным кислотам со структурой А9 независимо от их положения в отношении атомов углерода глицерина. Это наиболее специфичная из всех липаз грибов.

У Saccharomyces cerevisiae липаза связана с клеточной мем­браной и изолируется из нее при переваривании клеточной обо­лочки. Большей частью липазы грибов относительно стабильны и имеют оптимум действия при pH 8,0. Скорость гидролиза липазой триглицеридов по положению С-1 у Mucor javanicus выше, чем ди­глицеридов по положениям С-1, С-3, вероятно, потому, что дигли­цериды менее электрофильны, и она падает в направлении: три — глицериды-»-С-2, С-3-диглицериды-*моноглицериды. Быстрее гид­ролизуются также триглицериды, содержащие олеиновую и
линолевую жирные кислоты, чем линоленовую, вероятно, в резуль­тате изменения под ее влиянием конфигурации триглицерида вследствие обилия двойных связей и затруднения образования его комплекса с энзимом.

Образование липаз грибами — важный элемент процесса сы­роварения с применением грибных заквасок на основе Pйnicillium roquefortii и P. kamemberti. Острый вкус мягких сыров типа рок­фора зависит в значительной мере от свободных жирных кислот, вторично образующихся сложных эфиров и альдегидов, являю­щихся конечными продуктами процессов, катализируемых ли­пазами.

Виды грибов, обильно образующие липазы, обычно являются виновниками прогоркания масел или порчи масличных семян (Eggins, Coursey, 1968), туалетного мыла, коррозии и закупорки масляных и топливных баков, маслопроводов авиационных мото­ров, что приводило даже к воздушным катастрофам. Порча гри­бами произведений живописи с использованием масляных красок тоже зависит от разрушающих способностей этих грибов, обильно выделяющих липолитические ферменты (Курицына, 1968).

Рис. 6.9. Места дейст­вия на фосфолипиды фосфолипаз А), Аг, В, С и Д (Weete, 1980)

Фосфолипазы, гидролизующие фосфолипиды, изучались у не­многих грибов. Всего насчитывают порядка пяти таких энзимов, обозначаемых как Аь А2, В, С и Д (рис. 6.9) и отличающихся по местам производимого ими гидролиза (We — ete, 1980). Фосфолипазы А] и А2 катали­зируют отщепление ацилированных жирных кислот по положению С-1 (Aj) и С-2 (А2).

Эти реакции способна производить также фоефолипаза В. Фосфолипазы С и Д явля­ются собственно фосфатазами, так как они отщепляют фосфорную кислоту по ее —Р—О— связям, первая в месте контакта с С-3 атомом глицерина, а вторая с осно­ванием, например с холином или этанола- мином. Соответственно продуктами этих реакций оказываются в первом случае фос- форилированное основание (например, фос — фатидилхолин), во втором одно основание (например, холин).

Обнаруженные у грибов фосфолипазы способны производить полное деацилирование 1,2-диацилглицерофосфатидов до глице — ро-3-фосфата и двух жирных кислот, а также до 1,2-диацилглице — рида и фосфорилированного основания (например, о-фосфатидил — холина) и являются широкоспецифичными. Фоефолипаза D была открыта только у растений.

Наиболее полно была исследована фоефолипаза из Pйnicillium notatum, активная в отношении диацилфосфолипидов и стимули­руемая кардиолипином и фосфатидилинозитом. Фоефолипаза А была найдена в сухих дрожжах и гидролизовала фисфатидилхо — лин, трансформируя его в лизофосфатидилхолин и глицеро-3-фос-
фатидилхолин. Фосфолипаза В из Р. notatum активировалась анио­нами, возможно, вследствие участия их в диспергировании фосфо­липидов в результате увеличения отрицательного потенциала суб­страта. Это подтверждается возможностью их замены обработкой ультразвуком. Оптимальная активность фосфолипазы В из Р. no­tatum достигается при pH 4,0 и усиливается при введении —S—S— связей. Фосфолипаза В была также найдена у Sclerotium rolfsii и имела при этом оптимум действия при pH 4,5.

О нахождении фосфолипазы С было сообщено некоторыми ав­торами для дрожжей, бактерий Ervinia carotovora и некоторых фитопатогенных грибов. Необычный энзим с фосфолипазной активностью был найден у Rhisopus arrhizus, катализирующий гидролиз триацилглицеридов в положении С-1 и С-3. Сходный с энзимом Rhisopus фермент был обнаружен в панкреатической же­лезе свиньи.

Карбогидразами называют ферменты, производящие сопровож­даемое гидролизом расщепление углеродсодержащих безазотистых соединений, например, различной степени сложности углеводов. Поскольку именно такие субстраты чаще всего используются гри­бами как источник углерода, ферменты этого типа, образуемые ими, весьма обильны и разнообразны.

К ним относятся прежде всего ферменты, действующие на ди­сахариды, такие как инвертаза (или сахараза), расщепляющая сахарозу на фруктозу и глюкозу, трегалаза и мальтаза, делящие соответственно на две молекулы глюкозы трегалозу и мальтозу, и лактаза, расщепляющая на глюкозу и галактозу дисахарид лак­тозу. Ферменты этой категории, будучи широко распространены у грибов, имеются все же не у всех. Например, у Chaetoceratosto — та longirostre отсутствует инвертаза, и при росте без глюкозы, которая способствует образованию у нее красного пигмента, ее колония на среде с. сахарозой остается неокрашенной. Вследствие этого данный вид может служить тестом для обнару­жения инвертазы у других грибов, в совместной культуре с кото­рыми на среде с сахарозой его колония становится окрашенной пигментом, синтезируемым на базе глюкозы, образующейся в ре­зультате действия инвертазы культивируемого вместе с ним вида гриба.

Ферменты этого типа могут быть не только конститутивными, но и адаптивными. Например, у Saccharomyces fragilis таковым является инвертаза, образование которой усиливается очень резко на среде с сахарозой и которая почти не образуется на средах с рафинозой, лактозой или мелибиозой (Девис и др., 1966). У дру­гих дрожжей адаптивным ферментом является энзим, участвую­щий в усвоении галактозы, образование которого стимулируется выделенным из них термостабильным фактором.

Трегалаза, видимо, также является адаптивным ферментом у миксомицета Dictyostelium discoideum, постепенно накапливающи­мися у него в процессе прорастания спор (Cotter, Raper, 1966). Кроме миксомицета Dictyostelium трегалаза была также обнару-

f

ceHa в мицелии и склероциях в культуре Sclerotinia sclerotiorum Wang-Sy-Jing, Le Tourneau, 1972). Очищенный фермент имел оп­тимальную активность в пределах pH около 5,0 и константу Ми — хаэлиса, равную 1,7• 10—3. Еще ранее трегалаза была также обна­ружена у базидиомицета Schizophyllum commune (Williams, Nie — derpruem, 1968).

Некоторые дрожжи накапливают расщепляющие дисахариды ферменты в больших количествах, что позволяет использовать их в промышленных целях. Например, к числу таких видов относится Fabrospora fragilis, образующая Я-галактозидазу (лактазу) и ока­завшаяся наиболее эффективной среди пятидесяти испытанных одновременно с ней штаммов дрожжей.

Олигосахариды с a-D-галактозным остатком, широко распрост­раненные у растений и животных, гидролизуются а-галактозида — зой, встречающейся как среди дрожжей, так и нитчатых грибов. Среди 89 культур дрожжей, принадлежащих к 21 роду, она обна­ружена только у двух испытанных видов рода Schwanniomyces, S. occidentalis и S. alluvius, причем наиболее активен был первый из этих видов, культивируемый на среде с молочной сывороткой (Улезло и др., 1980). Среди нитчатых дейтеромицетов хорошим продуцентом a-галактозидазы оказался штамм из рода Cephalos — porium (Cephalosporium sp. 237), из культуральной жидкости ко­торого энзим осаждался этанолом или ацетоном и гидролизовал все три использованных субстрата: п-нитрофенил-а-0-галактопи — ранозид (гс-НФГ), к которому его сродство было наибольшим, ме — либиозу и рафинозу, но с оптимальной активностью при разных pH. Для гидролиза n-НФГ оптимальная активность находилась при pH 5,5, для мелибиозы — при pH 5,0 и для рафинозы — при pH 6,0. Препарат фермента содержал примеси протеазы и инвер — тазы, был стабилен в диапазоне pH от 5,0 до 9,0 и терял 40% активности в течение 10 мин при 50 °С. Для гидролиза субстрата n-НФГ оптимальная активность энзима наблюдалась при 40 °С (Запрометова и др., 1982).

Среди ферментов, расщепляющих сложные полисахариды, наи­более распространенным у грибов энзимом является амилаза. Она представляет собой, по существу, не один фермент, а комп­лекс энзимов, гидролизующих крахмал. В составе этого комплек­са в настоящее время числятся (Яровенко, Устинников, 1975): 1) a-амилаза (по промышленной терминологии АС), гидролизую­щая крахмал по связям 1—4 до неокрашивающих;ся йодом декст­ринов, а также до мальтозы и глюкозы; 2) декстриназа (ДС), гидролизующая конечные декстрины до редуцирующих сахаров, иначе называемая олиго-1-б-глюкозидазой по ее способности рас­щеплять крахмал по 1-6-глюкозидным связям; 3) обнаруженная •Фениксовой и Шиловой (1964, 1970) в культуре Aspergillus awa — mori, а позднее и у многих других плесеней глюкоамилаза, гидро­лизующая крахмал до глюкозы как по связям а-1,4, так и по а-1,6 (ГА). К числу ферментов комплекса амилазы присоединяют обыч­но н мальтазу (MC).

Декстриназа помимо способности расщеплять крахмал по глюкозидным связям оказалась способной формировать из глюко/ зидных остатков изомальтозу, панозу, мальтотриозу и другие сходные сахара, т. е. обладала одновременно свойствами трарс — гликозилазы с общей схемой действия фермента:

Две молекулы мальтозы =г=ь мальтотриоза + глюкоза.

Фермент этого типа особенно характерен для серии вида Л$- pergillus niger (Л. niger, A. batatae, A. awamori), но имеется также и у Л. огугае, хотя последний характерен больше высокой актив­ностью а-амилазы.

а-Амилаза грибов ингибируется тяжелыми металлами, а каль­ций является ее важным компонентом, стабилизирующим конфор­мацию фермента. Она достаточно кислотоустойчива, так как со­храняет активность при pH 2,5 в течение 30 мин и имеет опти­мальную активность при pH порядка 4,5—4,8. Большинство глю­коамилаз также действуют в кислой зоне pH (3,5—5,5), но у не­которых грибов, например у Saccharomyces italicus, встречаются нейтральные глюкоамилазы с активностью при pH от 6,0 до 7,5. Этот фермент способен гидролизовать даже 1-3-глюкозидные свя­зи, и не только крахмал, но и конечные декстрины и гликоген. Он был обнаружен также у мукорового гриба Rhizopus delamar и у Endomycopsis sp. Температурные пределы его действия колеблют­ся от 40 до 60° С.

Амилаза почти всегда является конститутивным ферментом, даже у дереворазрушающих грибов (Lyr, 1959b), и широко рас­пространена в очень разнообразных таксойомических группах. Не содержат ее только некоторые оомицеты, например виды рода Phytophthora, выделяющие вместо нее вещества, индуцирующие биосинтез амилазы в пораженных ею клубнях картофеля. У поч­венных плесневых грибов из родов Aspergillus и Pйnicillium ами­лаза — распространена особенно широко, и именно виды этих родов обычно служат ее источниками для промышленности. Комплексы ферментов, составляющих их систему, гидролизующую крахмал, даже у видов одного рода могут быть неодинаковыми, от чего зависит выбор разных продуцентов для различных практических целей. Например, у Aspergillus огугае преобладает а-амилаза с оптимумом активности при pH 5,0—5,4, тогда как группа Л. niger обычно богаче глюкоамилазой, декстриназой и мальтазой. Индук­тором образования у Л. niger..амилазы является продукт гидроли­за крахмала мальтоза, а глюкоза подавляет ее синтез.

Среди видов рода Ascochyta и у близкого к ней рода Phoma присутствуют одновременно и а-амилаза, и глюкоамилаза, и от­дельные виды отличаются не столько по относительному их коли­честву, сколько по общему объему их продукции и скорости их формирования. Наиболее продуктивной оказалась в заданных условиях среды Ascochyta cucumeris, а наименее — Л. pisi и пред­ставитель рода Phoma, P. medicaginis (Решетникова, Успенская,

1981).

, Амилаза Penicilium chrysogenum подавлялась солями аммония, аактивировалась фенилуксусной кислотой и кукурузным экстрак — тбм и оказалась наиболее активной в нейтральной зоне pH от 6,4 до 7,0.

Близкому к амилазе ферменту, производящему гидролитиче­ское расщепление инулина, было присвоено название инулазы, но> в данное время ферменты этого типа называют фруктангидрола — зами. Согласно ранним исследованиям инулаза является адаптив­ным ферментом, образуемым Aspergillus niger в основном при росте его на среде с инулином, но не на средах с глюкозой или. мальтозой. Название фруктангидролаз присвоено ферментам, при­способленным к субстратам, в состав которых (как, например,, в состав инулина) входит фруктоза. Фруктангидролаз различают три категории: 1) собственно инулазу, гидролизующую только* инулин; 2) менее специфичную гидролазу, расщепляющую кроме инулина леван и сахарозу; 3) леваназу, фруктангидролазу, рас­щепляющую только леван и освобождающую из него помимо- фруктозы ее олигосахариды (Элисашвили и др., 1980). Последняя оказалась полезной в стоматологии для профилактики и лечения кариеса.

Внеклеточную леваназу оказалось возможным получать из культуральной жидкости Fusarium solani 68 при помощи осажде­ния ее сульфатом аммония и гель-хроматографии на сефадексе G-150. Максимальная активность ее наблюдалась при pH 6,8, тем­пературе 45° С и концентрации полисахарида 6,7 мг/мл. Фермент отличался стабильностью при pH от 5,0 до 7,5 и при 40—45 °С. Константа Михаэлиса для этого энзима была равна 1,5-10-6 М.

Комплекс ферментов, разрушающих клетчатку до целлобиозы и затем до глюкозы, носит общее название целлюлазы. Эф­фект ее действия в отношении древесины особенно ярко виден у грибов, возбудителей ее деструктивной гнили, при которой древе­сина теряет свою волокнистую структуру, буреет, растрескивается и легко растирается в порошок, что особенно характерно для по­ражения домовыми грибами — Serpula (Merulius) lacrymans, Со — niophora puteana (C. cerebella) и другими. Этапы разрушения дре­весины этими и другими грибами были тонко изучены на цитохи­мическом и электронно-микроскопическом уровне (Liese, Schmied, 1962; Liese, 1970; Peek et al„ 1972).

Уже более двадцати лет назад было установлено, что целлю­лоза, как и амилаза, у большинства из ее продуцентов представ­лена комплексом из нескольких ферментов, свойства которых были, первоначально изучены (Jermyn, 1956) на модели дейтеромицета Stachybotrys atra, а позднее на других объектах (Selby, 1968). В итоге было установлено наличие у грибов комплекса из трех энзимов (рис. 6.10): 1) фактора набухания, вызывающего подго­товку к дальнейшему расщеплению, и набухание высококристал­лической целлюлозы, ПО-ВИДИМОМу, идентичного фактору Cl по классификации Селби; 2) термостабильной «вискозиметрической»- целлюлозы, эндоэнзима, разрушающего несколько более низкомо —

.лекулярную целлюлозу, понижая ее вязкость вследствие ее рас/ щепления на цепи меньшей длины. Конечными продуктами ее дей­ствия являются сначала олигосахариды, а потом целлобиоза’и глюкоза. Расщеплять целлобиозу она не может. Видимо, она иден­тична с С*-фактором по классификации Селби; 3) термолабильной р-глюкозидазы, экзоэнзима, расщепляющей [5-глюкозидную связь

Нативная целлюлоза

Сх компонент целлюлазы (вероятно «фактор набухания» по Джёрмену)

М = 30 000

Твдратированные полиангидридные——————————————————————

цепи целлюлозы

Сх компонент («вискози — Р-глюкозидаза

метрическая целлюлаза») (вероятно М = 5 300)

М = 55 000 (термолобильная)

Деллобиоза | Целлобиаза Т люкоза-<————————————————————— Раствор фермента Относительная целлюлазная активность Cl 1 С* 5

Рис. 6.10. Схема последовательности действия целлюлитических ферментов и относительной их активности поодиночке и в смеси (Selby, 1968)

концевого мономера глюкозы в цепи, которая является единствен­ным продуктом действия этого фермента. Как и мальтаза в ком­плексе амилазы, в случае комплекса целлюлазы в него входит энзим целлобиаза, расщепляющий на две молекулы глюкозы со­ставляющий клетчатку дисахарид целлобиозу (см. рис. 6.10).

Механизм действия ос — и (i-глкжозидаз, соответственно расщеп­ляющих полимеры целлюлозы по ос — и [5-связям, изучался тем же Джермином (Jermyn, 1958) и, по его мнению, ои состоит в обра­зовании тройного комплекса — энзим — донор — акцептор, где ак­цептором обычно является вода. При разрушении этого комплекса получается конечный продукт гидролиза — глюкоза. Молекуляр­ная масса приведенных на рис. 6.10 энзимов согласуется с глуби­ной их действия. Она равна 55000 для «вискозиметрической» цел­люлазы, 30 000 для фермента Ci (фактора набухания) и всего около 5300 для jj-глюкозидазы. В комплексе действие этих фер­ментов резко усиливается, как это видно из сравнения гидролити­ческого эффекта компонентов комплекса поодиночке и совместно (см. рис. 6.10).

Продолжение изучения целлюлозолитических ферментов грибов в последнее время, проводившееся с привлечением продуцентов йз дейтеромицетов, в частности вида Geotrichum cand. id. um (Тиу — нова и др., 1982), показало наличие среди (}-глюканаз специализи­рованных типов энзимов по отношению к определенным глюкозид — ным связям (1-3, 1-4 или 1-6). Использование в качестве субстра­та ламинарина позволило выявить у G. candidum активность 1-3- р-глюканазы, пустулина — 1-6-р-глюканазы. Выявлялись также при росте в течение 75—100 ч 1-4-(}-глюканаза (С*-фермент), об­разующаяся после 70 ч роста (}-глюкозидаза, расщепляющая цел — лобиозу, и по расщеплению хлопкового волокна Срфермент Сел­би. Исследование р-глюканаз с помощью изоэлектрического фоку­сирования в градиенте pH показало, что все эти энзимы являются кислыми белками с изоэлектрическими точками в пределах от

1, 3—2,0 до 6,4 и каждый тип, судя по числу пиков кривой элюции, содержит от четырех (у 1-3-р-глюканазы) до семи (у 1-4-(}-глюка — назы) фракций изозимов.

Изучались также экзоцеллюлазы дереворазрушающего бази — диомицета Irpex lacteus (Kanda et al., 1978). Проводилось также специальное исследование у 31 вида грибов-дереворазрушителей активности Срфермента, которое показало, что он обнаруживает­ся только у 7 из них, в основном являющихся возбудителями бурой гнили. К их числу принадлежали Coniophora areda, С. olivacea, С. puteana, Hygrophoropsis aurantiaca, Paxillus panuoides, Serpula himantoides и S. pinastri (Nilsson, 1974).

Наиболее энергичными разрушителями целлюлозы естественно являются дереворазрушающие грибы-базидиомицеты, которые и оказались наилучшим образом изученными в отношении их цел — люлаз (см., например, Lyr, 1959b, 1960; Musilek, 1981; Nilsson, 1974). Комплексы обнаруживаемых у этих грибов целлюлитиче — ских ферментов были различны в зависимости от вида гриба. Так, у Polyporus annosus и Flammulina (Collybia) velutipes (Norkrans, 1957; Lyr, Ziegler, 1959) была найдена как термостабильная цел — люлаза, так и термолабильная fS-глюкозидаза с различной актив­ностью у разных штаммов Flammulina, тогда как у Hydnum hen — ningsii и Polyporus schweinitzii оказалась только (i-глюкозидаза, дающая в качестве продукта гидролиза одну глюкозу. Напротив, у Polyporus betulinus по понижению вязкости карбоксиметилцел — люлозы была обнаружена только «вискозиметрическая» целлюла — за (Bell, Burnett, 1966). Помимо указанных здесь видов дерево­разрушающих грибов целлюлаза была обнаружена у рода Irpex, у которого она стимулируется марганцем, у Phellinus igniarius (Стайченко, Федоров, 1969), у Polyporus abietinus, Tricholoma, Porta vaillantii и y видов Corticium.

Среди почвенных дейтеромицетов также встречается большое количество продуцентов целлюлаз, в чем можно убедиться, выра­щивая их при посеве почвенной суспензии или комочков почвы на фильтровальную бумагу (Verona, Lipidi, 1966) или на среду с до­бавкой в качестве источника углерода целлюлозного порошка.

К числу целлюлозоразрушающих форм почвенного происхождения принадлежат различные виды Aspergillus, Cephalosporium, Chae — tomium, Humicola, Malbranchia, Sporotrichum, Thermoascus и дру­гие. Много целлюлозоразрушителей оказывается среди термофиль­ных видов. К числу разрушителей целлюлозы относятся также разрушители бумаги Eidamelia deflexa, Sporotrichum bombycinum, Aspergillus terreus и Pйnicillium purpurogenum (Нюкша, 1969)». а также гриб Archangium violaceum. Однако из числа дейтероми — цетов наиболее активными и наилучше изученными продуцентами, целлюлазы оказались Trichoderma viride, Myrothecium verrucaria (Whitaker, 1954, 1956) и Stachybotrys atra (Jermyn, 1956). У по­следнего из этих грибов был обнаружен набор из четырех компо­нентов целлюлазы, тогда как у Myrothecium verrucaria и Aspergil­lus niger установлены термостабильная целлюлаза и термолабиль­ная Я-глюкозидаза. У Myrothecium Я-глюкозидаза оказывается бо­лее эффективной, если длина цепочек разрушаемых ею олигоса­харидов возрастает с двух до пяти мономеров глюкозы в их со­ставе.

Целлюлазы, видимо, в большинстве случаев являются адаптив­ными энзимами, которые не образуются на средах с глюкозой и целлобиозой, а главным образом при росте иа средах с клетчат­кой (Lyr, 1959). Это было установлено для Tricholoma, Polyporus — annosus (Norkrans, 1957), Fomes pinicola, Schizophyllum commune* Trametes versicolor (Reese, Levinson, 1952) и целого ряда других грибов-дереворазрушителей. Оптимальное значение pH для ак­тивности этих ферментов находится обычно в пределах от 5,0 до 6,0.

К наиболее распространенным у древесных растений полиме­рам, которые ранее обобщали в категорию гемицеллюлоз, относят­ся ксиланы, преобладающие у лиственных пород, и маннаны, встречающиеся в большом количестве у хвойных. Расщепляющие их ферменты ксилаиазы и маннаназы встречаются обильно как у дереворазрушающих грибов-трутовиков, так у многих сумчатых грибов, например Chaetomium globosum (Sцrensen, 1957), и дей — теромицетов. Обильны они и у паразитических грибов. Среди последних гемицеллюлазы изучались у Fusarium roseum, Sclerotium rolfsii, у Botrytis cinerea и Aureobasidium pul — lulans (Berndt, Liese, 1971). При этом у Botrytis cinerea и Aureo­basidium pullulans была обнаружена манианаза, у Chaetomium globosum ксиланаза, а у Sclerotium rolfsii оба этих энзима с до­полнением галактаназы и а-1,6-галактозидазы. S. rolfsii оказался способным расщеплять галактомаинаны, а ряд других грибов — разнообразные пентозаны. По-видимому, большинство энзимов этого типа являются у грибов адаптивными, например, у большей части грибов образование ксиланазы стимулировалось ксиланом (Sцrensen, 1957; Lyr, 1959). Оптимальное значение pH для актив­ности этого фермента лежит, по некоторым данным, в пределах 3,0—3,8, а продуктом гидролиза является ксилобиоза, расщепляю­щаяся далее до ксилозы (Рипачек, 1967).

Поскольку маннаны более широко представлены у хвойных, анализировали наличие соответствующих ферментов у паразитов этих пород деревьев. Ферменты, расщепляющие а-Э-маннозидные связи, были найдены у паразита ели трутовика РЬеШпиэ аЫеНв (гоисИоуа е! а1., 1977а, б). У Р. иЫекв были обнаружены два типа подобных экстрацеллюлярных энзимов — типа экзоманнана — зы, отщепляющей конечную группу маннозы, и эндоманнаназы, расщепляющей маннан на его олигомеры, а также ос-маннозидазу.

Пектолитические энзимы широко распространены как у дереворазрушающих, так и у почвенных и особенно у фитопато — генных грибов, у которых изучалась пектолитическая способность •более чем для восемнадцати видов в связи с предполагаемой ролью этих энзимов в патогенезе или в проникновении в растения ■через их корни.

Среди пектолитических энзимов, которые, как и другие гидро- лазы, часто являются комплексом ферментов, различают четыре вида: 1) протопектиназа, или пектинлиаза, освобождающая пектин из его лабильного соединения с клетчаткой; именно этот энзим считается основным виновником мацерации тканей растений, я испытывают его обычно по этому симптому при посеве гриба — продуцента на ломтики картофеля; 2) полигалактуроназа, или лектиназа (ПГ), определяемая чаще всего по понижению вязкости раствора пектина илн пектата кальция, производящая разрыв по­лимерной молекулы полигалактуроновой кислоты, составляющей пектин, по ос-1,4-уронидным связям на более низкомолекулярные фрагменты или мономеры галактуроновой кислоты (рис. 6.11);

Рис. 6.1il. Действие иа пектин полигалактуроназы (ПГ) и пектииметилэстераэы (ПМЭ) (Банфилд, 1963)

3) пектинметилэстераза, или пектаза (ПМЭ), определяемая по титрованию освобождающихся кислых групп полигалактуроновой кислоты или спектрофотометрически; она представляет собой эсте — разу, расщепляющую эфирную связь полигалактуроновой кислоты с метиловым спиртом (см. рис. 6.11). У видов, способных расщеп­лять высоко метоксилированные пектины, она встречается обычно в паре с полигалактуроназой (ПГ), так как последняя неспособна расщеплять такие пектины без их предварительного деметоксили — рования; 4) обнаруженная позднее всех других пектолитических энзимов пектинтрансэлиминаза (ПТЭ), расщепляющая уронидные- связи пектина без его предварительного деметоксилирования.

Этот энзим сильно отличается от двух предыдущих, имеющих оптимум действия в кислой среде (при pH 4,0—5,0), тем, что его максимальная активность проявляется в щелочном диапазоне меж­ду ^рН 7,5 и 8,5 (Ayers, Papavizas, Diem, 1966; Васильева, Метлиц — кий, 1968; Васильева и др., 1968). Если исходить из этого обстоя­тельства, то отличающиеся по оптимальным значениям pH пекти­новые энзимы Botryiis cinerea (оптимум pH 4,0—5,0) и Pythium debarianum (оптимум pH 8,0—9,0) должны быть: первый — поли^ галактуроназой, а второй — пектинтрансэлиминазой соответствен­но (Ashour, 1954). Пектолитический энзим Aureobasidium pullu — lans также оказывается по этому признаку пектинтрансэлиминазой (Berndt, Liese, 1971).

Полигалактуроназа, встречающаяся у Neurospora crassa, по ее — описанию несколько отличается от обычной по оптимальному для ее действия pH и термолабильностью. Она разрушается при 70 °С и дает в качестве продуктов гидролиза довольно высокомолеку­лярные полиурониды с молекулярной массой около 1300. Одиако последний признак не особенно характерен, поскольку и обычная ПГ дает первоначально высокомолекулярные продукты гидролиза, постепенно распадающиеся при длительных экспозициях на моно­меры. В последнее время пектинметилэстеразу и полигалактуро — назу рассматривают как единый ферментный комплекс, называе­мый полиметилгалактуроназой, различая лртшь его экзоформу, от^ щепляющую ко’нцевую молекулу галактуроновой кислоты,, и эндоформу этого энзима, расщепляющую пектин иа его олиго­меры (Михайлова и др., 1982).

Относительно степени адаптивности пектолитических энзимов — единодушного мнения пока нет и они в этом отношении еще недо­статочно изучены. Полигалактуроназа рассматривалась первона­чально как конститутивный энзим (Gвumann, 1949), что, видимо,, подтверждается и для Pйnicillium chrysogenum, хотя пектинметил — эстераза у него адаптивна. Однако у дереворазрушающих грибов ПГ адаптивна и резко стимулируется на средах с пектином (Lyr, 1959, 1960). Точно так же оказываются адаптивными энзимы это­го типа у Aspergiltus niger (Фениксова, Молдабаева, 1967). По поводу ПГ Botrytis cinerea возникают значительные разногласия. Одни считают ее у всех видов Botrytis конститутивным (Талиева, Плотникова, 1962), другие находят, что ее образование стимули­руется пектином, т. е., что она адаптивна (Ashour, 1954). У этого гриба, а также у Sclerotinia sclerotiorum декстроза даже на среде с пектином угнетала образование ПГ. Тоже касается ПГ Rhizoc — tonia solani, которая в одних работах фигурирует как конститутив­ная, в других — как адаптивная (Ayers, Papavizas, Diem, 1966), как и соответствующий фермент гриба Aphanomyces euteiches.

Пектинтрасэлиминаза (ПТЭ) у Rhizoctonia solani оказалась адаптивной, а у Pythium debarianum конститутивной. Единствен­

ный пектолитический энзим, найденный у Phytophthora infestans,— пектинметилэстераза оказалась конститутивной (Clarke, 1966).

Одновременное наличие у продуцента эндо- и экзоформ ПГ можно установить по непропорциональности между понижением вязкости и увеличением количества редуцирующих концевых ос­татков мономеров, что особенно выявляется в случае наличия одной эндоформы энзима. У грибов встречаются и те и другие формы фермента, в частности у дрожжей. У дереворазрушающих грибов — трутовиков установлена экзо-ПГ (Lyr, 1959; 1963),. у Neurospora — эндо-ПГ, так же как и у Aphanomyces euteiches. При исследовании ПГ в конидиях Colletotrichum orbiculare как эндо-, так и экзоформа ПГ показали более высокую активность в их матриксе, чем в нативном материале, что говорит о поверх­ностной локализации их в клетках.

Пектинолитические энзимы грибов встречаются в самых раз­нообразных сочетаниях, хотя наиболее часто обнаруживается у них полигалактуроназа, найденная в спорах ржавчины Puccinia. glumarum, Р. triticina и Р. suaveolens (Талиева, Плотникова, 1962), у дрожжей, Botrytis cinerea, Penicillium chrysogenum, Neurospora crassa и Aphanomyces euteiches. В сочетании с протопектиназой она была обнаружена в спорах Aspergillus niger и у трех видов Botrytis — В. cinerea, В. anthophila и В. allii, а также у Sclerotinia sclerotiorum и в сочетании с пектинметилэстеразой у Ceratocystis fimbriata и Verticillium dahliae, а с обоими этими ферментами (протопектиназой и ПМЭ) у Fusarium oxysporum f. vasinfectum (Васильева, Метлицкий, 1968). Без сопровождения другими пек — толитическими компонентами протопектиназа была также найде­на у Colletotrichum trifolii, пектинметилэстераза у Phytophthora infestans (Clarke, 1966) и Sclerotinia sclerotiorum, а пектинтранс — элиминаза у Rhizoctonia solani (Ayers et al., 1966) и Pythium de — barianum.

Как можно видеть из этого перечня, пектолитические энзимы особенно обильны у паразитных грибов, поражающих корни рас­тений или проникающих в них через корни. В этом отношении особое внимание привлекают два фермента: протопектиназа и

пектинтрансэлиминаза. По материалам Талиевой и Плотниковой (1962), протопектиназа из трех видов рода Botrytis оказалась наи­более выраженной у форм с большей адаптацией к паразитизму (В. anthophila и особенно В. allii) по сравнению с сапротрофным В. cinerea, что авторы связывают с транспортной, т. е. способст­вующей проникновению в растение функцией этого фермента. Вто­рым ферментом транспортного назначения, вероятно, окажется, специально для обитателей аридных (пустынных) щелочных почв, пектинтрансэлиминаза с ее оптимумом эффекта при pH около 8,0, очень близким к pH почвенного раствора этой зоны. Ферменты типа ПГ и ПМЭ с оптимумом действия при pH, близким к кислот­ности клеточного сока растений (от 4,0 до 5,0), вероятно, несут скорее «трофическую функцию» (по терминологии Талиевой) и шире всего представлены у почвенных сапротрофов и грибов де — реворазрушителей, что вполне соответствует занимаемой ими эко­логической нише.

Пектолитические ферменты грибов получают все большее прак­тическое значение и широко изучаются в этом плане (Банфилд, 1963). Известно, например, что мощный пектолитический комплекс возбудителя так называемой «благородной гнили винограда», В. cinerea, успешно использовался для осветления дессертных вин яри их созревании. Для стабилизации вин и при приготовлении ■фруктово-ягодных вин и соков пектолитические ферменты стали применять и в Советском Союзе, например, при изготовлении вин яз крыжовника или черной смородины (Датунашвили и др., 1976; Кишковский и др., 1974), однако значение их для промышленно­сти этим не исчерпывается. Они оказались очень полезными при обработке различных растительных продуктов, например при экст­ракции крахмала, витаминов, лекарственных веществ, при осаха- ривании сельскохозяйственных отходов или при заготовке кормов в животноводстве, в связи с чем в последнее время очень повысил­ся интерес к изучению именно этого класса ферментов.

В поисках полезных для различных целей продуцентов пекто — литических ферментов были обследованы разнообразные роды грибов, например 340 штаммов у 38 видов рода Pйnicillium и 132 штамма у 13 видов Fusarium (Айзенберг, Билай, 1970; Девдари — ани и др., 1982), Trichoderma koningii (Fanelli et al., 1978) и ряд <5азидиомицетов, например трутовики Fomitopsis cytisina и Irpex lacteus (Kawai et al., 1978). В ряде из этих работ выяснилось, что наибольший эффект в отношении мацерации растительных тканей дает, как и в случае целлюлаз, применение комплекса ферментов. Так, например, совместное применение полиметилгалактуроназ (ПМГ) и пектинтрансэлиминазы (ПТЭ) из Pйnicillium digitatum для мацерании тканей листа и клубня картофеля можно объяснить их различной активностью в отношении пектинов разного проис­хождения. Эндо-ПМГ P. digitatum лучше всего гидролизовала свекловичный и лимонный пектины, экзо-ПМГ — свекловичный и лектовую кислоту, а ПТЭ — яблочный и не действовала на пекто — вую кислоту. Вероятно, при этом играло роль не только сродство ферментов к разным пектинам, но и различия в оптимальных для их действия pH, которые имеют значения для экзо-ПМГ — 4,5, для эндо-ПМГ — 5,0, а для ПТЭ — 9,0 (Михайлова и др., 1982). Пек­толитические ферменты P. digitatum угнетаются ионами тяжелых металлов, как Fe2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Cu2+, и натрия, a также реду­цирующими, поверхностно-активными и хелатообразующими веще­ствами. Эндо-ПМГ несколько активируются ионами Са2+, а экзо- ПМГ — Mg2+ и А12+.

Изучались также пектолитические ферменты, образуемые не­указанными авторами видами родов Pйnicillium и Fusarium, кото­рые наилучшим образом очищались при помощи осаждения их ацетоном из сконцентрированной культуральной жидкости после роста грибов на среде со свекольным жомом (Давдариани и др.,

1982) . Полученный пектолитический комплекс содержал три пек — толитических фермента в препарате из Penicillium и четыре в пре­парате из Fusarium с оптимальными pH 4,5 и температурой 40°С для активности препарата из Fusarium и pH 5,0 и температурой 50 °С для активности препарата из Penicillium. В полученном пре­парате из Fusarium преобладали экзо-ПГ и эндо-ПГ, в препарате из пеницилла — пектинметилэстераза. ПТЭ была обнаружена толь­ко у Fusarium, и, кроме того, в обоих препаратах имелась большая примесь кислой протеазы и незначительная целлюлаз.

С позиций определения роли пектолитического комплекса эн­зимов в фитопатологии изучались также ферменты возбудителя вилта хлопчатника, Verticillium dahliae, у которого были обнару­жены ПГ, накапливающиеся при низком pH среды (5,5), и ПТЭ, синтезирующаяся при более высоком (pH 7,0—7,5). Оптимум рос­та и формирования ПТЭ был обнаружен при температуре 28— 30°С. Влияние на заболевание вилтом метеорологических факто­ров авторы связывают с тормозящим влиянием температуры выше 30 °С на образование патогеном ПТЭ (Согдиева, Васильева, 1975).

Поскольку мацерация растительных продуктов зависит не толь­ко от пектолитического комплекса, а часто от дополняющих их целлюлаз и протеаз, комплексные смеси, подобные получаемым Девдариани с сотр. (1982), оказываются более действенными, чем индивидуальные энзимы. Однако возможен и другой подход к этой практической проблеме. Помимо использования естественно син­тезирующихся продуцентов смесей гидролитических энзимов при­меняются также препараты, составленные путем смешивания по­лученных от разных продуцентов или путем последовательного экспонирования мацерируемого материала в ряде таких энзимов. Одна из таких процедур была разработана при мацерации листьев растений путем чередования обработки сначала пектофоетидином ТОХ и затем целлюлазой из термотолерантного штамма Aspergil­lus terreus (Логинова и др., 1980). Удобный для такой мацерации комплекс энзимов, содержащий целлюлитические, пектолитические энзимы, глюканазы и ксиланазы, был обнаружен у Fomitopsis су — iisina и Irpex lacteus (Kawai et al., 1978; Noguchi et al., 1978), причем последний трутовик продуцировал также значительное ко­личество протеиназы, что делало его пригодным и для целей пи­щевого производства (Suga et al., 1978). Ранее, для целей перера­ботки кормов для сельскохозяйственных животных, исследовался также состав энзимного комплекса, образуемого трутовиком Тга — metes sanguinea, который оказался продуцентом протеазы, целлю — лазы, глюканазы и пектиназы при росте в погруженной культуре.

Исследование семи энзимов (протеазы, целлюлазы, гемицеллю — лазы, амилазы, лакказы, каталазы и пероксидазы) плодовых тел 334 базидиальных и сумчатых макромицетов и их изозимов при анализе с помощью электрофореза в геле оказалось полезным для целей хемотаксономии (Lamaison, 1976).

Хитиназа несколько отличается от других карбогидраз тем, что она гидролизует азотсодержащее соединение — хитин. Однако •ее целесообразно рассматривать вместе с ними, так как хитин по своей структуре идентичен полисахаридам и отличается от них. лишь тем, что составляющие его мономеры представляют собой ацетильные производные глюкозамина. Хитиназа гидролизует хи­тин до ацетилглюкозамина и широко распространена у грибов. Ее можно обнаружить в плодовых телах базидиомицетов, как Copri­nus comatus, Phallus impudicus, Fistulina hepatica, и особенно у видов дождевиков Bovista и Lycoperdon. Этот энзим относительно термостабилен и активируется белком сыворотки крови. Появились — также сообщения о другом ферменте, свойственном мицелиальным грибам (например, Mucor rouxii), способном деацитилировать хи­тин с образованием хитозана.

Хитиназа является одним из основных компонентов комплекса, составляющего улиточный фермент, используемый в эксперимен­тальной микологии для получения сферопластов грибов, лишенных клеточной оболочки. Из 35 видов грибов, исследованных в отноше­нии образования подобного комплекса ферментов, были отобраны Coprinus macrorhizus f. microsporus, С. radians, С. micaceus, Dae — daliopsis styracina и Irpex lacteus (Kawai, 1970). Наиболее актив­ные продуценты этого комплекса, содержащего глюканазы, манна — назы, хитиназу, целлюлазы и протеазу, — Coprinus macrorhizus f. microsporus и С. radians — были способны гидролизовать про­теины, глюканы, маннаны и хитин.

Активно гидролизующий хитин дождевик — Lycoperdon perla — tum — образует энзимный комплекс, растворяющий оболочки; дрожжей (Musilkova et al., 1975а, б). Препарат этого комплекса как из природных плодовых тел, так и иэ энзимного концентрата, полученного при росте мицелия в погруженной культуре, полностью — заменяет энзиматически активный препарат из улитки Helix ро — matia.

Ферменты, участвующие в синтезе олиго — и полисахаридов, от­носятся к синтетазам и включают обычно в качестве кофакторов уридиловые, реже гуаниловые нуклеотиды. При исследовании, хлорнокислых экстрактов из мицелия грибов в них обычно обна­руживается при хроматографическом разделении большое количе­ство таких нуклеотидов, как уридиндифосфатглюкоза (УДФГ) и уридиндифосфатацетилглюкозамин (УДФАГ), — переносчиков мо­номеров глюкозы и ацетилглюкозамина (Крицкий, 1965; Мансуро­ва, 1966).

Синтетаза специфичного для грибов дисахарида трегалозы или микозы с рациональным названием УДФ-глюкозо-О-глюкозо-6- фосфат-1-глюкозилтрансферазы была обнаружена у гриба-слизе — вика Dict’yostelium discoideum. Количество этого фермента особен­но нарастало у Dictyostelium к моменту образования у него пло­довых тел (Roth, Sussman, 1966).

Дубильные вещества, в том числе и таннин, представляют со­бой глюкозиды кислот, являющихся производными полифенолов, в особенности галловой кислоты, содержащей три гидроксильные — группы и карбоксил в параположении к средней из них (рис. 6.12).. При гидролизе ферментом танназой таннин присоединяет воду ж

расщепляется на галловую кислоту и сахара (Фостер, 1950). Т а н — н а з а была открыта Ролленом еще в 1860 г., а продуцент ее Asper­gillus niger, обнаруженный прн брожении галловых орешков, был описан Ван Тигемом в 1867 г. Танназу образуют многие грибы, особенно связанные тем или нным образом с богатыми дубильными веществами широколиственными породами деревьев. Но наиболее активен среди ее продуцентов A. ni­ger. Это адаптивный энзим, обра­зующийся в присутствии в среде таннина или галловой кислоты. Од­нако дополнительная добавка в сре­ду до 10% сахара не только не сни­жает активности этого фермента, но и направляет деятельность гри­ба исключительно на гидролиз таннина, предохраняя от дальней­шего потребления им образующуюся галловую кислоту (Фостер, 1950).

но_ но<^Лсоон но — Галловая кислота т. и п Танноза Галловая..___________ Таннин + Н20———— кислота * Сахара Рис. 6.12. Формула галловой кис­лоты и реакция гидролиза танни — иа таииаэой

Ферменты, расщепляющие таннин и фенолы, часто встречаются у грибов, паразитирующих на древесных растениях. К их числу относится паразит, встречающийся на коре деревьев, Endothia pa­rasitica, поражающий их корни Trametes radiciperda (Fomitopsis annosa), и паразит, обитающий на хвое, Herpotrichia nigra. Изу­ченная достаточно подробно Endothia parasitica продуцирует два энзима: 1) эстеразу, расщепляющую эфиры галловой кислоты и танннны, 2) пирогалл азу, фермент типа оксидаз, разрушающий галловую кислоту и гидрохинон. Ингибиторами этих ферментов оказались 10%-й раствор глюкозы и гидрохинон. Наличие у па­разитных грибов ферментов этого типа приводит к тому, что мно — тие растения, богатые токсическими для грнбов дубильными ве­ществами, оказываются неустойчивыми к таким патогенам.

Эстер аз а, сходно с танназой расщепляющая глюкозиды, бы­ла обнаружена у гриба Coniothyrium diplodiella и получила назва­ние нарингиназы, исходя из ее способности расщеплять нарингин, глюкозид, содержащийся в оболочках плодов цитрусовых и обус­ловливающий горький вкус сока грейпфрута. Этот фермент, ко­торый мог бы найти применение для улучшения вкуса соков цит­русовых, оптимально активен при pH 4,2 и при 60—65° С. При 70 °С он инактивируется в течение 30 мин, но относительно ста­билен при обычных температурах в пределах pH от 4,0 до 6,0. Как и действие танназы паразитных грибов, его активность ингибиру­ется в присутствии в среде сахаров.

Протеолитические и фибринолитические ферменты. К числу тидролаз относятся также протеолитические ферменты грибов, ко­торыми они снабжены весьма обильно (Андеркофлер, 1963а), так как они способны широко использовать для питания разнообраз­ные белки и пептиды. Гидролизующие белки энзимы относят к категории протеиназ, гидролизующие пептиды — к категории пеп­
тидаз. Отличие пептидаз от протеиназ состоит в их способности отщеплять только концевые остатки аминокислот, в результате чего продуктами гидролиза оказываются только аминокислоты, №> не пептиды, как в случае протеиназ. Различаются эти ферментьь также и по оптимальным для их действия уровням pH: различают — ферменты типа пепсинов, активные в кислых диапазонах pH, и ти­па трипсинов, связанные с более щелочными условиями среды. В наличии протеолитических ферментов у грибов можно убедиться, при анализе результатов их изучения в мицелии Pйnicillium chry — sogenum, получаемом при ферментации пенициллина (Маттисон,, 1956)", и Aspergillus oryzae, выращиваемом с целью получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов для применения их в пищевой промышленности (Авиженис, Савицкай — те, 1969). Более подробный анализ показал, что в этот комплекс входят следующие энзимы: 1) протеиназы с оптимальной активно­стью при pH 5,0—6,5, расщепляющие альбумин и казеин; 2) пеп­тидаза типа триптаз, отщепляющая концевые аминокислоты при pH 7,0—7,5; 3) пептидаза, проявляющая активность при pH 8,0— 8,4. Две последние расщепляют желатину и пептон (Маттисон, 1956). Все эти ферменты способны пептонизировать коллаген кожи.

В препарате из мицелия Aspergillus oryzae, оризине ПК, с по­мощью разделения на сефадексе G-100 были обнаружены три. фракции протеаз, а при разделении на сефадексе А-50 — пять фракций (Авиженис, Савицкайте, 1969), которые различались пс их действию на казеин, гемоглобин и синтетические субстраты. Судя по данным дискового электрофореза, они были составлены различными белками. Среди них были обнаружены два энзима с оптимальной активностью в кислом (pH 4,5 и 5,0) и два — в ще­лочном диапазоне (pH 7,0 и 10,0), и они различно реагировали на соли Са2+, Mn2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Zn2+, Hg2+, Cd2+. Кислые про — теазы теряли активность в присутствии детергента, ЭДТА и цис — теина. Другие разнообразные грибы при их изучении также обна­руживали протеолитическую активность, например корневая губка Fomitopsis annosus.

К протеолитическим ферментам близки по свойствам керати — нолитические, объединяемые под названием кератиназы, спо­собные гидролизовать кератин шерсти, рога, волос и перьев. От­личие их от протеолитических энзимов состоит в том, что они, ве­роятно, способны энергично воздействовать на дисульфидные спайки, особенно многочисленные в кератине.

Кератинофильные грибы довольно часто выделяются из неко­торых почв (Шатин, 1964), и среди них встречаются как типичные дерматофиты, например Microsporium gipseum и М. cookei, так и сапротрофы вроде Karatinomyces ajelloi. Сюда же, видимо, отно­сятся встречающиеся нередко в почвах горных пастбищ Средней Азии виды Sporotrichum. Кератинолитической способностью обла­дают патогенные для человека и животных дерматофиты, а также — обнаруживающийся на шерстепрядильных фабриках в обстановке — высокой влажности Myrothecium verrucaria, являющийся разруши­телем шерсти в условиях производства. Механизм действия и свойства ферментов этой категории пока, видимо, недостаточно изучены.

Одну из важнейших категорий протеолитической группы энзи­мов в связи с их медицинским значением представляют собой фи — бринолитические энзимы. Фибринолитические ферменты грибов, еще в 60-х годах привлекли внимание исследователей ввиду воз­можности их применения для консервативного лечения тромбоэм­болических и других заболеваний, связанных со свертыванием крови. По своей природе и тнпу действия эти ферменты близки к трипсину и к другим ферментам типа протеиназ, но многие из них, обладая слабой казеинолитической способностью, высокоактивны в отношении гидролиза фибрина, а некоторые одновременно сти­мулируют активность фибринолитических систем крови. К послед­ним относятся стрептокиназа, получаемая из Streptococcus haemo — lyticum, и трихолизин — из гриба Trichothecium roseum, тогда как обладающие фибринолитическим действием, но неизвестные как активаторы фибринолиза в организме животного энзима выделя­лись преимущественно из видов рода Aspergillus.

Идея использования ферментов грибов для ликвидации тром­бов и эмболий, по-видимому, принадлежит Стефанини, получивше­му первый инъекционный препарат этого типа «Аспергиллин О» из Aspergillus oryzae, представляющий собой нейтральный белок, осаждающийся солями тяжелых металлов (Cu2+, Zn2+, Cd2+). Сходный препарат из штамма того же вида гриба был получен в Советском Союзе (Кудряшов и др., 1963; Егоров, Ландау, 1965). Термолабильный препарат из A. orysae, названный аспергиллином (Струкова, 1965), отличался от выделенной из него несколько ра­нее аспергиллопептидазы В по оптимальному значению pH, типу действия, молекулярной массе и аминокислотному составу. Еще сильнее отличалась от них аспергиллопептидаза А, выделенная из Aspergillus saitoi, оптимально действующая в сильнокислой зоне (pH 2,5—3,0) и способная активировать трипсиноген и химотрип — синоген. Ее субстратная специфичность была шире трипсина, и она представляла собой одноцепочечную структуру с С-концевой группой серина и С-концевой группой аланина с дисульфндной связью. Кроме названных из числа фибринолитических ферментов видов рода Aspergillus, относительно хорошо изученных, необхо­димо отметить террилитин из A. terricola (Имшенецкий и др., 1965; Имшенецкий, Броцкая, 1967; Самсонов и др., 1972) и браназу из A. ochraceus. Оба этих фермента очень сходны по молекулярной массе и аминокислотному составу и характеру их действия на фибрин и другие белки, но отличаются по опти­мальному для их активности pH и их изоэлектрической точке. Из выявленных спектрофотометрически по пикам поглощения двух компонентов террилитина (Коршунов, 1965, 1969) основной ком­понент (с оптимальной активностью при pH 8,0—10,0) представ­ляет собой нейтральную протеазу, активируемую солями Си2+ и

Zn2+ в концентрации I0-2, с небольшой примесью кислой (опти­мальный pH 5,0) (Самсонов и др., 1972). Браназа, очищенная с помощью хроматографии на DEAE-сефадексе (Tцpfer, Pischer, 1974), имеет оптимальный уровень pH 7,8—8,0, активируется и стабилизируется ионом Са2+ (Roschbau, Ives, 1974).

Близкий к этим ферментам по молекулярной массе трихолизин из Trichothecium roseum сильно отличается от них по аминокис­лотному составу и типу действия, сходному с действием стрепто — киназы. Помимо фибринолитической способности он активирует in vitro и in vivo плазминоген кровн (Андреенко и др., 1968; Andreenko et al., 1974). Трихолизин представляет собой сложный комплекс, содержащий свыше пяти активных компонентов. Конт­роль с помощью электрофореза в полиакриламидном геле выявил после разделения изоэлектрофокусированием только одну индиви­дуальную нейтральную фракцию IV с оптимальным для активно­сти pH в пределах между 8,5 и 9,0, которая была изучена наибо­лее подробно, почти лишенную казеннолитической активности, но с высоким фибринолитическим и активирующим плазминоген эф­фектом. Все остальные фракции с ИЭТ от 3,7 до 10,0 также были способны к фибринолизу, хотя и с большей примесью казеинолити — ческого действия, и содержали по 2—3 компонента, но оптималь­ное pH лежало для всех в одном диапазоне от 8,0 до 9,0 (Степа­нова, 1977).

Довольно глубоко изученным оказался также протеолитический и фибринолитический фермент из Torula ‘thermophila с оптималь­ным для его активности pH в нейтральной и щелочной зоне и кон­цевой группой глицина (Караваева, Мухитдинова, 1976; Мухитди­нова, Караваева, 1976). Фибринолитическая и протеолитическая активность была также найдена у ферментов двух видов рода Pйnicillium пептидазы А из Р. anthinellum с молекулярной массой 32 000 и оптимальной активностью при pH 3,0—4,0 (Hoffman, Sham, 1964; Shaw, 1964) н термолабильной протеазы из P. lilacinum с фибринолитическим эффектом в широком диапазоне pH от 4,0 до

11, 0, являющейся комплексом металлоэнзимов с различной моле­кулярной массой (Андреева и др., 1972, 1973; Егоров н др., 1972).

Способность активно продуцировать протеолитические фермен­ты у грибов очень развита, что можно видеть из исследований (Егоров и др., 1971; Прудлов и др., 1972), в которых была обна­ружена эта активность у 48 штаммов из полученных 59 (около 81%), относящихся к родам Cladosporium, Fusarium н Alterneria. При’ этом протеазы из Fusarium solani, F. graminearum, Alternaria geophila и Alternaria sp. 62 представляли собой комплексы фер­ментов с фибринолитической и тромболитической активностью в нейтральной и щелочной зонах pH (Егоров и др., 1972).

Из приведенного здесь перечисления можно видеть, что мик- ромицеты являются очень перспективными источниками фибрино — литических ферментов для применения в медицине. Они слабо токсичны и многие из них (трихолизин, террилитин, браназа и аспергиллин) проходят в настоящее время клинические испытания, а «Аспергиллин О» давно уже является промышленным препара­том, применяемым в медицине США.

3. Окислительно-восстановительные ферменты и

дыхательные цепи грибов

Реакции, производимые большинством из окислительно-восста­новительных ферментов, являются крайне необходимыми для ос­новного обмена грибов, поскольку они участвуют как в получении необходимой для синтетических процессов! энергии, так и в подго­товке исходных субстратов для этих синтезов, например, в форме восстановления нитратов или сульфатов. Вследствие их интимного участия в построении клеток они чаще бывают эндоэнзимами и имеются у всех грибов.

Окислительные энзимы делятся на: 1) дегидрогеназы, дейст­вующие по пути, установленному Виландом с отнятием от субстра­та водорода, и 2) оксидазы, действующие, согласно теории Вар­бурга, через присоединение к субстрату кислорода. Однако это различие нельзя считать принципиальным, поскольку существуют дегидрогеназы, связывающие кислород, а роль большинства окси — даз сводится только к переносу электронов путем изменения ва­лентности входящего в их состав металла. Кроме того, большинст­во из этих ферментов в восстановленном состоянии действуют как редуктазы (оксидоредуктазы).

Дегидрогеназы в большинстве случаев имеют в качестве ко — ферментов или простетических групп никотинамид или флавины в форме НАД, НАДФ, ФМН или ФАД. В случае НАД-дегидроге- наз вторым кофактором большей частью бывает Zn2+, а вторым компонентом органической простетической группы — аденин, как в никотинадениндинуклеотиде. Аденин является также вторым компонентом флавинадениндинуклеотида.

Наилучшим образом изучены дегидрогеназы дрожжей и неко­торых плесневых грибов, в особенности Aspergillus niger. Триозо- фосфатдегидрогеназы дрожжей и A. niger обычно содержат в ка­честве второго кофактора Zn2+, например, представляющая собой однокомпонентный белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, алкоголь — дегидрогеназа, фосфофруктокиназа и ряд других де­гидрогеназ, участвующих в гликолитических путях ЭМП и ГМФ, как альдолаза и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (Bertrand, de Wolf, 1958; Wacker et al., 1958). Необходимость цинка для дейст­вия этих энзимов доказывается подавлением активности фермента

1 : 10 фенантролином. При присоединении двух молекул ингиби­тора к одному атому Zn2+ энзим инактивируется необратимо. В алкогольдегидрогеназе одна молекула ферментного белка ком­бинируется с четырьмя атомами цинка. Содержащие цинк дегид­рогеназы подавляются многими факторами, например, фенантро — лин связывает цинк, Р-хлормеркурбензоат и Ag2+ — активные SH-группы, мочевина — ферментный белок.

Участие в действии таких ферментов в качестве кофакторов НАД и НАДФ было доказано также с помощью гистохимических методов, основанных на образовании формазана из нитросинего тетразолия при инкубации с НАД или НАДФ и с соответствую­щим субстратом дрожжевых грибов Paracoccidioides brasiliensis и Saccharomyces cerevisiae (Reiss, 1967). В случае Saccharomyces cerevisiae исследовалось этим способом наличие НАДФ-пирид — оксинфосфатдегидрогеназы, трансформирующей пиридоксинфос — фат в пиридоксальфосфат. При этом помимо установления специ­фичности этой реакции путем подтверждения эффективности дей­ствия всех обнаруженных биохимическими методами ингибиторов (хлормеркурбензоат и антагонист пиридоксина 4-деоксипиридок — син-HCl) было отмечено отсутствие связи этого фермента с мито­хондриями. С помощью введения акцепторов электронов (дихлор — фенолиндофенола или трифенилтетразолиумхлорида, ТТХ) было установлено наличие двух энзимов — НАДН2- дегидрогеназы и ал — когольдегидрогеназы у базидиомицета Oudemansiella mucida, при­чем дегидрогеназа НАДН2 оказалась промежуточным переносчи­ком электронов в дыхательной цепи этого гриба. В случае окисле­ния исходных субстратов с гидрофобными свойствами часто роль промежуточного переносчика переходит к НАДФН2-дегидрогеназе, для формирования которой необходимо присутствие фосфорили — рующего НАД-энзима; НАД-киназы. Именно с формирования это­го фермента начинается прорастание конидий Neurospora crassa, и максимум его накопления достигается уже через 30 мин от нача­ла их инкубации в воде (Афанасьева и др?, 1982).

В начале интенсивного вегетативного роста гриба, при потреб­лении углеводов, активность НАД-кииазы сильно падает и снова нарастает при спаде интенсивности роста через сутки инкубации. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле было обна­ружено, что НАД-киназа у N. crassa присутствует в четырех фор­мах субъединиц с разной молекулярной массой, из которых наибо­лее высокомолекулярные (I и II) характерны для конидий, а III форма с меньшей в 11,2 раза молекулярной массой преобладает в вегетативном мицелии (Афанасьева и др., 1982).

Дегидрогеназа, содержащая флавины, в частности глюкозоок — сидаза (Я-D-глюкоза: 02-оксидоредуктаза), содержащая ФАД,

была впервые обнаружена Мюллером в отпрессованном соке из Aspergillus niger еще в 1926 г. В дальнейшем она была установ­лена у A. oryzae, Pйnicillium notatum, P. chrysogenum, дрожжей и ряда других грибов (Андеркофлер, 19636). Этот фермент, окисля­ющий глюкозо-6-фосфат в 6-фосфоглюконат, наряду с 6-фосфо- глюконатдегидрогеназой был найден также у различных видов Phytophthora (Clare, Zentneyer, 1966). Из других дегидрогеназ в прорастающих спорах Puccinia recondita обнаружена дегидроге­наза яблочной кислоты (Macko, Novacky, 1966), а в спорах гри — бов-трутовиков Trametes versicolor и Phellinus igniarius — флавин — содержащая ксилозооксидаза. К числу флавиновых дегидрогеназ относится также сукцинатдегидрогеиаза. Участие флавиновой си­

стемы в дыхательной цепи было также обнаружено у базидиоми — цета Oudemansiella mucida, а флавинсодержащие галактозоокси* даза и глюкозооксидаза у Polystictus circinatus. Флавиновые эн­зимы О. mucida типа глюкозо-2-оксидазы оказались способными окислять моносахариды в соответствующие им гексозулозы, на­пример 0-арабино-2-гексозулозу (Vole et al., 1978, 1980).

Оксидазы не все способны самоокисляться с присоединением кислорода, как это должно быть исходя из теории Варбурга. Фер­менты этого типа скорее можно обобщить, исходя из структуры их простетических групп, которые в подавляющем большинстве случаев представляют собой порфирины со строением гема, состав­ленного из четырех пиррольных фрагментов (рис. 6.13). Азотные компоненты гема способны высвобождать валентности, могущие удерживать в центре этой структуры какой-либо металл. Приме­ром типа такой структуры может служить строение протопорфи — рина IX (рис. 6.14). Наиболее типичны среди них цитохромы, со­держащие железо, осуществляющее реакцию переноса электронов типа

—в

Fe2+ ZHHHFe3+.

+“•

Биосинтез порфиринов (рис. 6.15) исходит из глицина и сукци — нилкоэнзимаА, причем при декарбоксилировании и отнятии воды на первом этапе получается 8-аминолевулиновая кислота. При дальнейшей циклизации получается порфобилиноген, из четырех фрагментов которого формируется уропорфиринШ. Четвертый этап биосинтеза состоит в потере уропорфириномШ четырех мо­лекул СОг с трансформацией его в копропорфириногенШ, кото­рый, теряя еще две молекулы СОг и окисляясь, превращается в протопорфириноген1Х. Дальнейшее его окисление с потерей четы­рех атомов водорода приводит к образованию протопорфирина1Х.

У головневых грибов в синтезе цитохромов, видимо, принимает участие цинк, что видно на примере Ustilago sphaerogena, резко повышающего продукцию цитохрома в присутствии повышенных доз цинка. То, что цинк участвует при этом в синтезе белкового — компонента энзима, можно видеть из результатов внесения одно­временно с цинком специфичного ингибитора И-РНК актиномици — на D, который полностью подавляет синтез цитохрома у Ustilago sphaerogena (Brown et al., 1966). Наиболее подробно цитохромы изучались у дрожжей, однако с помощью спектрофотометрии они также были обнаружены у очень большого ряда гифообразующих грибов из всех классов (Lindenmayer, 1965).

В настоящее время у грибов известно восемь видов оксидаз со строением цитохромов, относящихся к трем из четырех известных типов структур этих ферментов. У них встречаются цитохромы

а, аи аз, Ь, Ь, Ь2, с и сх. Не обнаружен у грибов только встреча­ющийся у бактерий цитохром типа d.

Большая часть этих энзимов участвует в переносе электронов в дыхательной цепи, и только два из них (аі и Ь) образуются в анаэробных условиях. Цитохром 62 отличается от всех других ци — тохромов тем, что он постоянно связан с ДНК, состоящей из 30 нуклеотидов, потеря которой, однако же, не влияет на активность фермента. Функции этого цитохрома состоят в специфическом окислении лактата и других оксикислот.

,СН Н3

tiC<

)с

N N не’ ^СН Ч_/ X / І II нс*ч /Ч /с ^сн сн сн сн

СН2 Тип реакции: Fe2+ ^ Fe5+

CH

Рис. 6.13

Лротопордіирин Ш

Рис. 6.14 Рис. 6.13. Строение порфиринового ядра; Ме — металл Рис. 6.14. Строение протопорфина IX и тип реакции гемовых ферментов

У грибов известен также не вошедший в сводку Линденмейера цитохром Р-450, окисляющий алканы и другие липиды через мо- нооксигеназную микросомальную систему, содержащую кроме цитохрома Р-450 еще НАДФНг, цитохром P-450-редуктазу и фос — фолипидный компонент (Мауэрсбергер, Матяшова, 1980). Она формируется при росте на я-алканах как единственном источнике углерода и энергии у Candida tropicalis, C. guillermondii, Torulop — sis candida, участвуя в окислении алканов и жирных кислот. При достижении стадии торможения роста дрожжей концентрация ци­тохрома Р-450 в их клетках значительно снижается. Этот фермент является адаптивным, специфически формирующимся при росте дрожжей на средах с гексадеканом, пальмитиновой кислотой или при использовании эндогенных липидов после исчерпания источ­ника углерода при росте на среде с глюкозой (Ильченко и др.,

1980) , что было установлено при исследовании культур Candida lipolytica, C. tropicalis, C. utilis, C. guillermondii и Torulopsis Can­dida Оксигеиазиая система, включающая цитохром Р-450 и

соон соон соон сн, I I I ‘

соон сн, I I 2 сн, сн, I ‘ I 2 с——- с

/ N Н Порфобилиноген

соон снг Р1* СOSКоА

сн,

Н20, со,

2Нг0

=0

СукцинилКоАф NHfCHf СО CHjCDnHj-CHj-C СН (D

ch2nh2 соон Глицин

/ N н2 S-аминолевули — нодая кислота

соон соон £нг

сн, I 1 сн2

COOK

сн2 сн2 сн, сн, I 2 I 2 I 2 I 2 соон сн2 сн2 соон t соон соон t Уропрофин й

сн2	сн2 сн3	сн3 сн2	сн2 сн.	сн3 сн2	сн2 сн3
сн, 1	сн2	сн, 1 1	сн, 1 *	сн2	сн2
соон	соон	соон	соон	соон	соон

Протопорфирин Ж

ПротопорфириногенШ

Копропорфириноген Ш

Рис. 6.15. Биосинтез порфирииов (Девис и др., 1966)

НАДФН, подавляется оксидом углерода (II), но является цианид — резистентной и нуждается в наличии молекулярного кислорода, предпочтительнее использует алканы со средней длиной цепн, окисляя их сначала в соответствующие алкоголи (и гидроксипро — изводные) и альдегиды, а потом в жирные кислоты (Weete, 1980). Пигмент гемопротеин Р-450 был впервые открыт у Saccharomyces cerevisiae в корпускулярной фракции гомогената его клеток.

Путь окисления алканов при посредстве цитохрома Р-450 пока­зан в табл. 6.8. Субстратспецифичные оксигеиазы грибов, функ-

Таблица 6.8

Схема окисления л-октаиа Candida llpolytlca при участии цитохрома Р-450 (Weete, 1980)

НАДФН+Н+ НАДФ+ НАДФ+ НАДФН+Н+ НАДФ+ НАДФН+Н+

TOC o "1-5" h z I t I t I t

І І І (___________ J_______ І

с7н15—сн,——— с7нисн2он——————- ► с, н16сон——————— м:7н15соон

(1) (2) (3)

октаи 1-октаиол октаиал октаиоевая

кислота

(1) — п-октаигидроксилаза; (2) — 1 — октаиолдегидрогеназа; (3) — октаналдегидроге — наза.

ционирующие с помощью цитохрома Р-450, изучались в течение последнего десятилетия довольно интенсивно как в целях исполь­зования грибов для переработки различного типа углеводородов, так и в целях трансформации стероидов при изготовлении лечеб­ных препаратов типа кортизона. Одним нз ранних исследований этой категории было обнаружение у Aspergillus niger железозави­симой антранилатгидроксилазы, производящей двойное гидрокси — лирование антраниловой кислоты, но теряющей эту активность при росте гриба на среде с дефицитом железа или в присутствии о-фенантролнна. Фермент реактивировался в присутствии ферри — этилендиаминтетрауксусной кислоты (Ре2+-ЭДТА) илн феррицит — рата (Kumar et al., 1973). Позднее у гриба Acremonium sp. была обнаружена НАДФН-зависимая оксигеназа сходного типа, окис­ляющая этан сначала до этанола, а потом до ацетальдегида и со­ответствующей кислоты (Davies et al., 1976). Сходство этой окси — геназы с оксигеназой на основе цитохрома Р-450 состояло в том, что в бесклеточном гомогенате она оказалась связанной с фрак­цией. микросом. Однако испытание ее СО-спектра поглощения не дало характерных для цитохрома Р-450 результатов.

Способность производить гидроксилирование ароматических углеводородов свойственна мукоровому грибу Cuninghamella bainieri, причем связанный с этим окислением фермент содержит цитохром Р-450. Фермент НАДФН-зависимый, теряет активность в присутствии типичных для Р-450 ингибиторов (СО, SKF-525A и метирапон), имеет оптимальный pH 7,8 и обладает цианидрезис — тентностью. Кроме того, он связан с микросомной фракцией и его принадлежность к оксигеназам на основе цитохрома Р-450 под­твердилась его отношением к металлам (например, подавление активности Fe3+ и стимуляция ее Fe24-/ Ferris et al., 1976).

Гидроксилирование с помощью грибов стероидов и другие их трансформации, например, связанные с формированием двойных •связей в кольце, также производились, причем преимущественно «с применением грибов из числа дейтеромицетов. Способен произ­водить эти трансформации и ряд базидиальных грибов, например, гидроксилирование в положениях 2-0, 7-а, 7-0, 11-а, a также вос­становление кетоформ в позициях 20-0 в гидроксильную форму. Производить трансформации 3-0-гидрокси-5-андростен-17-она ока­зался способным базидиальный гриб-дереворазрушитель Pleurotus ‘Ostreatus (Thoa et al., 1978). Некоторые виды грибов способны производить и обратные реакции, приводящие к восстановлению окисленных форм гидроксисоедннений. Такая реакция, производи­мая гидроксипируватредуктазой, была обнаружена у Aspergillus Jiiger.

Уже давно было установлено, что цитохромная дыхательная щепь грибов, исключая микросомальные оксигеназы, связанные с цитохромом Р-450, находится в митохондриях. Первоначальные ис­следования цитохромов грибов проводились спектроскопически на неразрушенном мицелии или на нефракцнонированном его гомо — генате. Из исследованных 45 видов грибов все содержали цито — хромы типов а, b и с и цитохромоксидазу (а3), хотя некоторые из них показывали отличия друг от друга в деталях спектров погло­щения.

Позднее исследовалась фракция отмытых при центрифугирова­нии при lOOOOXg митохондрий базидиомицета Schizophyllum com­mune, как нативных, так и в присутствии различных ингибиторов (Niederpruem, Hachett, 1961). Дыхание митохондрий ингибирова­лось соответственно 97, 95 и 85%-м фенилмеркурацетатом, анти — .мицином А, блокирующим дыхательную цепь на уровне перехода между цитохромом b и с и блокирующими цитохром аз цианидом и азидом, а также высокими концентрациями (порядка 10_3—10-4) динитрофенола, разобщающего окисление с фосфорилированием. Митохондрии S. commune окисляли НАДН особенно в присутствии цитохрома с, восстанавливающегося при включении в систему цианида. Этими и другими тестами было показано наличие в ми­тохондриях цитохромов Ь, с и а—а3, подтверждаемое не только подавлением системы цианидом, но и реакцией подавления дыха­ния в темноте оксидом углерода (II). В митохондриях S. commune выявлены также сукцинатцитохром с редуктазная, цитохром с, НАДН — и сукцинатоксидазная и цитохром а оксидазная системы. Расчет на основе спектрофотометрических измерений показал четко эквимолярные концентрации в митохондриях а, Ь и с типов цитохромов.

Исследовался также дифференциальный спектр (при —196 °С) фракции митохондрий Agaricus campestris var. bispora (Gallinet, 1974, 1976), показавший, что в них содержатся цитохромы а—а3

и, по-видимому, не менее трех цитохромов с пиками поглощения при 552, 557 и 562 нм, а также цитохромы с и С. Соотношения цитохромов типов а, b и с были равны 1,0: 1,5: 2,0 соответственно. Сопоставление этих данных с соответственными расчетами для других видов грибов показывает близкие соотношения цитохромов только у Aspergillus niger, тогда как у дрожжей Saccharomyces carlsbergiensis и Neurospora они увеличиваются для цитохромов. b и с более прогрессивно (табл. 6.9).

Таблица 6.9 Подсчет концентраций трех типов цитохромов, определяющих их стехиометрию у разных видов грибов (Gallinet, 1974), нмоль/мг белка Цитохромы Agaricus campestris Aspergillus niger Saccharomyces carlsbergiensis Neurospora crassa а 0,22 (1,0) 0,15 (1,0) 0,15 (1,0) 0,24 (1,0) Ъ 0,32 (1,5) 0,19 (1,3) 0,28 (1,9) 0,66 (2,8) с 0,44 (2,0) 0,39 (2,6) 0,65 (4,3) 1,32 (5,6)

Исследование кинетики восстановления цитохромов Agaricus campestris показало, что у него присутствуют только два цитохро — ма типа Ь, которые восстанавливаются в присутствии сукцината, с пиками поглощения при 559 и 562 нм, обнаруживаемые при тем­пературе жидкого азота (—196°С).

Цепь переноса водорода (или электронов), т. е. дыхательная цепь в полном ее виде, включает еще и другие компоненты, а именно ферредоксины и коэнзим Q. Ферредоксины или железо — серопротеины мало изучены в отношении их структуры. Известно, что они включаются в митохондриальный перенос электронов в тесном сочетании с флавиновыми энзимами в процессе их контак­та с пиридиновыми дегидрогеназами. В их составе имеется раз­личное количество (от двух до семи атомов) негемового железа и такое же количество лабильных сульфгидрильных групп, осво­бождающихся в виде H2S при подкислении. Подробнее изучены ферредоксины — участвующий в фотосинтезе хлоропластов шпи­ната и в усвоении атмосферного азота, выделенный из анаэробно­го микроба Clostridium pasterianum (Ленинджер, 1974), но счи­тается, что они есть и у грибов (Lyr et al., 1975).

Коэнзим Q относится к числу хинонов, формирующихся в шун­те терпенов (рис. 6.16) и совершенно несходных по структуре с.

щитохромами. К ним относятся обнаруживаемые у грибов убихи — ноны и убихроменолы.

Убихиноны различного строения обнаружены сейчас у значи­тельного числа грибов, как дрожжевых, так и гифообразующих из жлассов сумчатых, базидиальных и несовершенных грибов (1лп-

о

■Шхинон(Щп) снз-0~|Г|ГгСНз 8<п<Ю снгоДу%нгсн=с-сн^н

О СН3

ОН

Убихромшл(иСп) СН^-О-Л^^г-СНз

*Н3-оА^СН^СН^С-СН^СН^СН<-СНфН.

£4 п< 10 СН

‘з

^— 0—/ СН,————————- СН,

о

СН.-Й’^Ч-Н

Пластохинон (Рй3) Сн’ОсНгСН=МН2]-Н

I лз 0 СН3

ОН

Витамин £ СНз-г^^гСНз

{а-токоферол] СН3А^СНГСНгС-СН^СНгСНгСНЧН^-Н

-■2 ‘*,у] -2 1-2 —2 | —

_0_/сн3 сн3

о

Витамин К, цЗС^СН^С^С-СН^СНз-СН^-СН-СН^-Н

О СН3 СН3

Рис. 6.16. Строение хинонов, участвующих в транспорте электронов в дыхатель­ной цепи

<3епшауег, 1965). Образуются оии как в анаэробных, так и в аэробных условиях, и установлено их место в дыхательной цепи между флавинами в сочетании с ферредоксинами и цитохромом Ь (Ленинджер, 1974).

Расположение упоминавшихся выше ферментов в дыхательной цепи и связь ее с метаболитами цикла трикарбоновых кислот при­ведены на рис. 6.17. Оно слагается из последовательности: НАД-> -►флавопротеид (ФМН)-*-кофермент (убихино’н)-»-цитохром Ь-*- -►цитохром с (или С—с)->-цитохром а-*-кислород воздуха. Конеч — ным продуктом реакции является вода.

Параллельно существует также система, начинающаяся с фла — виновой сукцинатдегидрогеназы (кофермент ФАД), субстрат сук — цинил-КоА, переносящая электроны прямо на убихинон. Сходный

Ацетил-КоА

Оксалацетат

НАД ♦ Флавопротеид

Нитрат ч Цисамнитат Изоцитрат |соП*-1Д _____ а-Кетоглутарат [со? " .Сукцинат

кофермент в » * Цитохром Ь______________ АДФ+ФН —————- *-АТФ Цитохром с

Рис. 6.17. Схема дыхательной цепи и окислительного фосфорялирования. Ко­нечные продукты стадий в рамке (Ле — нинджер, 1074)

Цитохром а АДФ+<Рн—*~11——— И

процесс претерпевают продук­ты распада жиров — глицеро­фосфат и ацилированные КоА производные жирных кислот (рис. 6.18). Путь переноса электронов через НАД возмо­жен с изоцитрата, малата и пирувата, также с глутамата и различных 3-оксиацилпроиз- водных КоА. На трех этапах дыхательной цепи может про­исходить сопряжение окисле­ния с фосфорилированием (об­разованием АТФ), а именно между ФМН и Ко<3, цитохро — мами Ь и с, цитохромом а и кислородом воздуха, где это позволяет высокая разность энергетических потенциалов — перехода коэнзимов (£</)• Альтернативные дыхатель­ные цепи грибов. Истинное место убихинона (коэнзима (^) в дыхательной цепи грибов вскрылось в связи с исследо­ваниями в области механизма действия различных ингибито­ров дыхания (рис. 6.19). Об­наруженные ранее альтерна­тивные пути переноса протонов (двух атомов водорода) — первый через НАД->флавин — мононуклеотид (ФМН) и неге — мовое железо (ферредоксин) (I), второй через сукцинат->флавинадениндинуклеотид (ФАД) и другой железосеропротеин (II) — оказались сходящимися. Место их соединения — это этап цепи переноса, занятый коэнзимом (^, с которого осуществляется передача заряда на цитохром.

Блокирование цианидом, оксидом углерода (II) или азидом этапа цитохрома а + цитохромоксидаза (цитохром аз) приводит к прерыванию перехода от окисленного состояния к восстановлен­ному и обратно всех компонентов цепочки цитохромов, что на мо­дели клеток животных дает в результате полное прекращение ды­хания. Однако у целого ряда нечувствительных к цианиду грибов дыхание при этом не прекращается, причем даже тогда, когда блокируется с помощью ротенона, дексона или амитала начальный

этап цепи I через НАД и ФМН. Блокировка антимицином А пере­хода от цитохрома Ь к цитохрому с может в этом случае привести даже к стимуляции дыхания. Полное прекращение дыхания дости-

Изоцитрат Глутамат	Малаш
3-оксиоцил — Ко А
НАД (-0,32)
ФП1
1-0,22)
Ко А •производное мирной кислоты ♦ <РП3
Сукцинапг ___ <РП2 (ФАД):
Цитохром Ь (+0,050) АТФ |
Цитохром с,(+ 0,220)

Цитохром с (+0,254)

Цитохром а+а3 (*0,28)

*-атф

О (+0,82)

Рнс. 6.18. Места вхождения электронов от различных субстратов в дыхатель­ную цепь и места окислительного фосфорялнрования: ФП — флавопротеины; в скобках уровни Е0′, V (Ленннджер, 1974)

гается только при одновременном с цитохромами блокировании карбоксином, теонилтрифторацетатом (ТТФА) или 8-оксихиноли — ном этапов пути II через сукцинат, ФАД и железосеропротеин. При блоке одних этапов цитохромов дыхание значительно усили­вается, не уступая нормальному в контроле (Ьуг е1 а!., 1975). Это

прямо указывает на наличие альтернативного пути дыхания с усвоением кислорода через иные, чем цитохромы, пока еще не изученные акцепторы. Заблокировать этот путь можно только ма-

г-4—, .

1У1 Цитохром а/а3 [CNjCO •L ^ J Азид

Цитохром с

OI Цитох ш j

‘-Л-

Неизученный этап

! Цчтохром с, АнтимицинА

1

KOQ

FeSP,/FeSP2"l

Fe S Рп |ПтерицидинА

ТТФА Ф-OKCU — i хинолин | ‘ I I

I Дексон

■l’il

L <РМН J НАДН

ТТФА- теонил — трисрторацетон

^ФАД/ FeSPj

Малонат

Сукцинат

НЬЧ-железо — серопротеин

Рис. 6.19. Схема главной и альтернативной дыхательной цепи грибов и болоки — рующих различные этапы ингибиторов. Места действия ингибиторов указаны стрелками с волнистой чертой (Ьуг е1 а1., 1975)

лонатом или веществами, воздействующими на ферредоксиновый компонент цепи II, как карбоксин, 8-оксихинолин и ТТФА (см рис. 6.19).

На следующем этапе этого’ альтернативного пути могли бы. возможно, оказаться, например, меланины с их способностью ь аутоокислению и восстановлению, хотя до настоящего времени нх

окисление считается свободным, не связанным с способностью к фосфорилированию. Это в определенной степени поддерживается значительно меньшей потребностью меланинсодержащих форм в кислороде при их дыхании (Жданова, 1976) и цианидрезистент — ностью при чувствительности к блокаде цепи II окисления темно — окрашенных грибов как Trametes versicolor, Ustilago maydis, виды аскомицетов из порядков Helotiales и Sordariales (Lyr et al., 1975). Исключение составляет краснопигментная, но цианидорезистент­ная Rhodotorula mucilaginosa.

Наличие у грибов альтернативных путей дыхания имеет прин­ципиальное значение для отбора системных веществ, применяемых для борьбы с болезнями растений. Были проведены обширные экс­перименты на дрожжевых грибах из родов Torulopsis и Candida,, показавшие, что количество альтернативных путей переноса элек­тронов в дыхательной цепи грибов, видимо, достигает значитель­ного числа вариантов. Только у одного Torulopsis candida, по мне­нию исследователей, их намечается не меньше четырех (Ильчен­ко, Соколов, 1980). Прежде всего были замечены различия в пер­вых ступенях цепи переноса, заключающиеся в замене блокируе­мого цианидом обычного пути электронного транспорта цианид — резистентным, формирующимся при росте на нормальных алканах, сопровождаясь продукцией цитохрома Р-450, участвующего в их гидроксилировании до алканоло’в (рис. 6.20). При росте на глю­козе цитохром Р-450 не появлялся до ее полного исчерпания (Ильченко и др., 1980).

Метаболизм п-алканов (а также, видимо, ряда жирных кислот и лнпидов), как выяснилось из опытов с ингибиторами, протекает на базе микросомальной фракции цитоплазмы (Ильченко, Соко­лов, 1980) при участии НАДФ и цитохром-Р-450-редуктазы. Он ингибируется, сходно с подавлением ингибиторами микросомаль­ной оксигеназы, СКФ-525А, метирапоном и бензогидроксамовой кислотой (БГК). Эта система была обнаружена кроме Torylopsis candida еще у трех видов Candida (C. guillermondii, C. tropicalis и C. lipolytica/Мауерсбергер, Матяшова, 1980), которые все были способны утилизировать для роста л-алканы, и отсутствовала у не растущих на этом субстрате видов.

Помимо этой системы, связанной с цианидрезистентным путем, блокируемым БГК (Ильченко, Соколов, 1989), по-видимому, име­ется второй устойчивый к цианиду путь переноса электронов, где конечное окисление осуществляется за счет перекиси водорода при участии цитохром-с-пероксидазы. Схематическое изображение описанных путей переноса электронов у Torulopsis candida приве­дено на рис. 6.20.

Среди других альтернативных путей дыхания грибов известно наличие цианидрезистентного митохондриального пути окисления у гифообразующих грибов, например у Moniliella tomentosa. У это­го гриба такое дыхание возникает под влиянием нормальных про­панола и бутанола, тогда как метанол и этанол не способны его индуцировать. Причина индукции цианидрезистентного дыхания

заключается в способности Сз и С* алкоголей интерферировать с окислительным фосфорилированием, что приводит к снижению роста и накоплению этилового спирта (Уепёег1еус1еп е! а!., 1978).

0:

.1

Цитохром a+oj

f

f- tmi і…… I

I § Ч £

KCN

Цитохром с

Неизбестный акцептор

Цитохром Ь

I § Є

Пероксидаза

Нг0г

KoQ?

KoQ

<РП3?

Ротенон

Цитохром Р — i*S0

CKCP-S2SA (или метирапон)

НОЛЫ

+0Н‘

НАДФ I t ъ п — алка- ! з:

НАД

СуВстрат (Глюкоза и др)

п • алканы (или липиды)

Рис. 6.20. Предположительная схема альтернативных путей переноса электронов у Torulopsis Candida и других дрожжей из рода Candida в зависимости от со­става среды и фазы роста: БГК — бензогидроксамовая кислота; АА — аитими — ции А (Ильчеико, Соколов, 1980)

Цианидрезистентность дыхания была также обнаружена у гри­бов Fusarium sambucinum (Акименко и др., 1981) и Fusidium coccineum (syn. Acremonium fusidioides Gams ДТелеснина и

.др., 1980), изучавшихся в связи с образованием ими антибиотиков знниатина и фузидиевой кислоты. Эксперименты проводились на фоне исследования ингибиторов дыхания. У Fusudium энергообес­печение, способствующее росту биомассы, связано в основном с окислительным фосфорилированием, локализованным в митохонд­риях, и с дыхательной цепью с включением цитохромов. Введение ингибирующего синтез ферментов этой цепи хлбрамфеникола пе­реводило активного продуцента фузидиевой кислоты полностью на цианидрезистентный путь дыхания, и выход антибиотика на ■единицу биомассы повышался в три раза. Наоборот, при ингиби­ровании цианидрезистентного дыхания салицилгидроксаматом он снижался в 4,5 раза. По этим данным, а также по нарастанию ин­тенсивности циаиидрезистентности от неактивных штаммов к обильно продуцирующим антибиотик (в конце ферментации от 15—16% До 90—100% от полной дыхательной активности) можно было вывести заключение, что синтез данного антибиотика тесно ■связан с ингибируемым гидроксаматами путем свободного окисле­ния, возможно, ароматических веществ, в котором, например, фор­мируются меланины.

В случае биосинтеза антибиотика рода Fusarium, энниатина, сходное исследование привело к несколько иным результатам (Акименко и др., 1981). Интенсивность синтеза энниатина связана «с потреблением пула АТФ, которбе более выражено в период уси­ленного роста и менее явно в стационарной фазе, в период наибо­лее активного синтеза антибиотика. Соответственно у активного лродуцента переход в конце ферментации на цианидрезистентное дыхание был менее выражен, чем у неактивного. И то и другое говорит о более, чем в случае фузидиевой кислоты, интенсивной «вязи биосинтеза энниатина с энергетическим обменом и синтезом новых ферментных систем, в частности связанных с затратой энер­гии гидролиза АТФ.

Авторы указанной работы считают, что цианидрезистентное дыхание, так же как и сверхсинтез метаболитов (например, ли­монной кислоты), является вариантом сброса избыточной свобод­ной энергии в случае цианидрезистентного дыхания, протекающе­го на уровне коэнзима Q в дыхательной цепи. Однако скорее все эке можно считать, что синтез лимонной кислоты (или например, этанола) нельзя причислять только к футильным («бесполезным») циклам, существующим исключительно для сброса лишней энер­гии, так как эти продукты легко используются в основном обмене. То же касается и близкой по структуре к стеролам и меланинам 4>узидиевой кислоты. Меланины, как и стеролы, помимо других функций используются в обмене, о чем говорит поддержка ими жизнедеятельности и синтезов, их окисление в процессе дыхания И включение В НИХ не ТОЛЬКО кислорода, НО И меченной ИЗОТОП0М углекислоты. Судя по согласованности эффекта гидроксаматов в отношении синтеза меланинов (Жданова, 1976) и цианидрезис­тентного дыхания (Телеснина и др., 1980; Акименко и др., 1981), их формирование должно идти именно при участии этого энерго­

дающего процесса на базе полифенолоксидаз. В пользу последней гипотезы в некоторой степени говорят также исследования группы авторов (Трутко и др., 1980) по влиянию на цианидрезистентное дыхание Candida lipolytica дефицита ряда микроэлементов.

Несмотря на сильное угнетающее влияние дефицита железа на синтез всех цитохромов (включая и цитохром с и его пероксидазу),. цианидрезистентное дыхание не угнетается, а даже стимулируется при его дефиците у данного организма. Правда, ускорение появле­ния цианидрезистентного пути в дыхательном метаболизме С. lipo­lytica наблюдается также и при дефиците меди, вследствие чего- вопрос о возможной природе цианидрезистентных оксидаз этого — организма остается пока в значительной мере открытым.

Полифенолоксидаза. К числу полифенолоксидаз, важных для некоторых путей окисления и формирования меланинов, ранее от­носили две категории: собственно полифенолоксидазы, или лакка — зы, окисляющие фенолы, и тирозиназу, окисляющую азотсодержа­щие соединения с бензольным кольцом, например тирозин или фенилаланин. Сейчас эти ферменты считают за единую группу. Ферменты этого типа, видимо, имеют строение гемов, однако » противоположность цитохромам в их состав входит не железо,, а обычно закисная медь. Поэтому грибы, образующие обильно ти­розиназу, нуждаются в повышенных дозах меди и могут иногда добывать ее из медьсодержащих фунгицидов. Железо и марганец могут выступать как конкуренты и ингибиторы лакказы.

Лакказой, окисляющей такие соединения, как перокатехин,. гидрохинон, резорцин, бензидин и т. п. в соответствующие хиноны,. обладает большинство грибов — дереворазрушающих базидиоми — цетов, например Oudemansiella mucida, Polyporus versicolor, Poly — porus zonatus, Collybia velutipes, Psalliota bispora. У всех этих грибов лакказа выделяется в окружающую среду, почему оии все дают реакцию Бавендамма на посинение введенной в среду гвая* кодовой кислоты (Lyr, 1958). Эта реакция отсутствует у возбуди­телей буровой гнили древесины, как. Coniophora cerebella (С. putea — na), Lentinus squamosus или Daedalea quercina. Их считали ранее неспособными образовывать полифенолоксидазы, однако в настоя­щее время выявилось, что многие из них, в частности возбудители бурой гнили из родов Polyporus и Coniophora, имеют внутрикле­точную полифенолоксидазу, которую они не способны выделять в окружающую среду. В частности, это касается Coniophora puteana (Rosch, 1966).

Среди грибов — возбудителей белой гнили — продуценты вне­клеточной лакказы встречаются очень часто, а среди обследован* ных Люром 103 видов дереворазрушителей их оказалось 47% (Lyr, Ziegler, 1959). Из Polyporus versicolor был получен и оха­рактеризован гомогенный препарат лакказы, которую он продуци­рует очень обильно. Стимуляторами полифенолоксидазы оказались органические растворители, например 50%-й алкоголь, предполо­жительно способствующий диссоциации требуемого для действия энзима компонента. Ингибиторами лакказы и, видимо, естествен­

но ными ее регуляторами являются нуклеиновые кислоты, как РНК, так и ДНК, а также другие соединения пуринов. Предположитель­но они связывают входящую в состав фермента медь, а также и белковый компонент фермента. Лакказа Polyporus versicolor и P. zonatus оказалась эффективной в пределах pH от 3,0 до 6,5 с оптимумом действия при pH 5,0 и продукция ее специфически уве­личивалась в 60 раз при введении в культуральную среду 33 мг/л йодида калия (Lindenberg, Fahreus, 1952).

Функция внеклеточной лакказы дереворазрушающих грибов начала разъясняться на модели грибов — возбудителей белой гни­ли древесины — в связи с выявлением роли фенолоксидазной сис­темы в разрушении лигнина, сопряженной с целлюлозоразрушаю­щей способностью этих грибов. Оказалось, что активность целлю — лаз при разложении древесины до конечного продукта, целлобио — зы, тесно связана с образованием фенолоксидазами хинонов и феноксирадикалов через действие энзима целлобиозохинонокси- .доредуктазы (Westermark, Eriksson, 1974). Это было показано на примере такого вида гриба — возбудителя белой гнили древесины, как Sporotrichum pulvirulentum, являющегося несовершенной ста­дией базидиомицета Phanerochaete chrysosporum. Окислительно­восстановительная система этого гриба (типа лакказы) играет ре­гулирующую роль в комплексных процессах разложения грибами лигнина и целлюлозы. Это было доказано тем, что мутант этого триба с дефицитом фенолоксидазы оказался способным разрушать лигнин только при добавке в его культуру лакказы (Ander, Eriks­son, 1976). Механизм этой регулирующей функции, изученный на примере гриба Pleurotus ostreatus, состоит, видимо, в том, что промежуточный продукт разложения целлюлозы — целлобиоза ■окисляется с помощью дегидрогеназ (целлобиозохиноноксидоре — дуктаз) с восстановлением хинона в феноксирадикал, возникаю­щий при деградации лигнина, заканчивающейся полимеризацией ■феноксирадикала и образованием меланина. Таким образом, цел­люлозоразрушающая и лигнинразрушающая способности грибов оказываются тесно взаимосвязанными и взаимно регулирующими друг друга (Hiroi, Eriksson, 1976).

Лакказа считалась неспособной окислять ароматические ами­нокислоты типа тирозина или фенилаланина. Эту способность при­писывали другому, близкому к ней по свойствам ферменту — ти — розииазе. Однако сейчас большей частью эти два фермента счи­тают идентичными. Тирозиназа также содержит в качестве кофер — мента медь, что доказывается реактивацией ее ионами Си2+ при подавлении синильной кислотой.

Тирозиназа, играющая большую роль в обмене животных при образовании дигидроксифеиилаланина (ДОФА), предшественника гормонов надпочечников адреналина и норадреналина, очень рас­пространена и у грибов микоризообразователей, таких как виды Boletus и Lactarius. Мякоти их плодовых тел свойственно синеть на изломе (у подосиновика, Boletus luridus, груздя, белянки и дру­гих видов Lactarius). Также синеет она у шампиньона.

Тирозиназа бывает как внеклеточной, выделяющейся в среду*, так и внутриклеточной, причем последняя была обнаружена у ря­да дереворазрушающих грибов, как Polyporus schweinitzii и P. sulphureus (Rфsch, 1966). Роль ее у грибов, вероятно, в неко­торых чертах сходна с ее ролью у животных, у которых продукты* образующиеся при действии тирозиназы (адреналин и норадрена — лин), принимают большое участие в явлениях проницаемости и. гомеостаза.

Поскольку регуляция проницаемости мембран особенно сильно — должна влиять на питание паразитных и микоризообразующих грибов, наблюдаемое обилие у них тирозиназы должно согласовы­ваться с этой точкой зрения. Другим доказательством ее правиль­ности является способность грибной тирозиназы образовывать из — L-тирозина или фенилаланина в присутствии аскорбиновой кисло­ты дигидроксифенилаланин (ДОФА)—предшественник адренали­на животных. Продуктом дальнейшего действия тирозиназы на. ДОФА или окисленные производные индола оказываются конден­сированные, соединения, укрупнение молекул которых ведет к об­разованию темного пигмента меланина и выявляется в форме — посинения мякоти плодовых тел на изломе. Сходным образом про­текает меланиногенез у животных.

Другой тип меланинов, не содержащих азота, например у Dal — dinia concentrica, образуется возможно уже при участии лакказы из продуктов конденсации соединений типа стероидов или фенан — трена. Однако такие меланины у грибов более редки, а чаще у них обнаруживаются азотсодержащие, сформированные из фрагментов ДОФА или индола. Приписываемая меланинам экологическая роль состоит во всесторонней защите от повреждений в экстре­мальных условиях обитания, включая солнечную, особенно уль­трафиолетовую радиацию, низкие и высокие температуры, сухость воздуха и субстрата. Защитный эффект меланина, по мнении» автора этой гипотезы (H. Н. Ждановой), неспецифичен и сводится к поддержанию нормального для грибной клетки уровня окисли­тельно-восстановительного режима, pH и ионной силы, смещаю­щихся под влиянием экстремальных воздействий (Жданова, 1976)*

Пероксидаза и каталаза. Среди оксидаз порфиринового типа, связанных как с кофактором с трехвалентным железом (Fe3+),. у грибов также обильно встречаются пероксидаза и каталаза^ Первая из них отщепляет кислород от органических перекисей, а вторая расщепляет перекись водорода с образованием атомар­ного кислорода и воды. Отличие этих ферментов от цитохромов заключается в том, что они не окисляют, а восстанавливают пере­киси, вследствие чего их активная форма не восстановленная, а окисленная и функционирует соответственно реакции: Fe3+-* ->Fe2+, а производимая ферментом трансформация субстрата вы­глядит подобно реакции: НгОг-^-НгО+О (Lindenmayer, 1965). Оба’ этих фермента широко распространены у грибов. Каталаза была обнаружена у Pйnicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Myrothe — cium verrucar. ia, Caldariomyces fumago (Shaw, Hager,1961), у ко-^ торого она участвует в системе окислительного хлорирования |3- кетоадипиновой кислоты и у базидиомицета Oudemansiella mucida. — Участвует она и в системе окисления глюкозо-6-фосфата в 6-фос — .фоглюконат у A. niger и других плесневых грибов (Андеркофлер, 19636). Пероксидаза, видимо, очень характерна для дереворазру­шающих грибов из категории разрушителей ядровой древесины. Среди изученных Люром 103 видов грибов-дереворазрушителей образующими пероксидазу оказалось только 12%, против 47%, •образующих лакказу, и все они относились к разрушителям ядра древесины дуба или сосны.

Отсюда возникает предположение, что окисление циклических компонентов лигнина, разрушителями которого являются эти виды, зависит от наличия у них пероксидазы.

Особенно много пероксидазы’ оказалось у видов из рода Phelli­nus, в частности у Phellinus igniarius (Lyr, 1959). Грибная перок­сидаза оказалась сходной с лакказой по их отношению к темпе­ратуре, хотя и близкой по другим свойствам к растительной перок — сидазе. Например, у нее очень близкий к растительной пероксида — зе оптимальный pH (5,0—6,3) и температурный коэффициент Qio (повышение активности при увеличении температуры на 10°), близкий к 2,0. Реакция ускоряется три таком коэффициенте до ■50%>но, вообще, термостабильность энзима зависит от вида гриба, например, у Phellinus robustus энзим инактивируется на 50% при 77° С, а у Fomes annosus при 60°С. Этанол в концентрации 4% инактивирует энзим. ‘

Каталаза и пероксидаза обильно накапливаются в мицелии Pйnicillium chrysogenum в процессе ферментации пенициллина, но главным образом внутриклеточно, а в среду выходят только в конце роста в начале автолиза клеток мицелия (Маттисон, 1956).

При анализе пероксидазной активности у грибов дейтеромице — тов, живущих на опавших листьях и на хвойном опаде, оказалось, что от 30 до 60% из их числа обладают этой способностью, осо­бенно при выращивании их на субстратах пероксидазного окисле­ния, таких как таннин, галловая кислота, пирогаллол, аскорбат или отвар дубовой коры. Те же виды почвенного происхождения обладали этой способностью не более чем в 1,6% случаев (Бори­сова, Двойное, 1972). К числу видов грибов, обладающих высокой пероксидазной активностью, относились виды рода Cladosporium (С. gossypicola, С. transchelii, С. ovorum) и Botryiis cinerea, осо­бенно активные при выращивании на средах с отварами из листь­ев березы и дуба.

Из других пероксидаз грибов можно назвать хлорпероксидазу, обнаруженную у Caldariomyces fumago, которая осуществляет трансформацию 0-кетоадипиновой кислоты в б-хлорлевулиновую кислоту (Shaw, Hager, 1961). Однако этот процесс, оптимизирую­щийся при очень низких уровнях pH (pH 2,8), происходит много­этапно, причем хлоропероксидазой осуществляется только послед­ний этап — окисление с замещением кислорода хлором. В пред­шествующих этапах этой реакции, которая возможна только в

присутствии всех компонентов комплекса, принимают участие: гидролаза, выщепляющая глюкозу из запасных полисахаридов, клетки; глюкозооксидаза, окисляющая эту глюкозу до глюконовой кислоты; каталаза, расщепляющая выделяющуюся при окислении глюкозы перекись водорода на воду и кислород, который в момент выделения с помощью хлорпероксидазы реализует использование хлор-иона для хлорирования Я-кетоадипата (Shaw, Hager, 1961).