Основной обмен соединений углерода у грибов

Основным обменом называют этапы обмена веществ, необхо­димые для поддержания жизни, роста и размножения организмов. Главной чертой его является менее выраженная специфичность, по сравнению с боковыми путями обмена. Он, в общем, сходен у всех живых существ и чаще отличается лишь некоторой возраст­ной специфичностью. Например, эмбриональные ткани получают энергию преимущественно через гликолитический путь Эмбден — Мейергофа — Парнаса (ЭМП), тогда как более зрелые характе­ризуются более развитым пентозным циклом или циклом гексо — зомонофосфата (ГМФ).

В качестве примера этого положения из области грибов могут служить прорастающие хламидоспоры Ustilago maydis, которые через 12 ч после начала их проращивания еще не имеют энзимов для усвоения сахаров через путь ГМФ и ферментов цикла Кребса, но уже обладают комплексом энзимов, участвующих в усвоении сахаров по пути ЭМП (Blumental, 1965). В спорах Tilletia caries имеется только серия энзимов для метаболизма сахаров по пути

Энтнер — Дудорова (ЭД), в котором отсутствует фосфорилирова — ние глюкозы, тогда как в мицелии вместо них обнаруживаются энзимы, действующие при метаболизме сахаров через пути ЭМП и ГМФ.

У больших таксономических групп, стоящих на сильно удален­ных друг от друга ступенях филогенеза, степень развития отдель­ных этапов основного обмена может также довольно резко отли­чаться. Например, у оомицетов цикл Кребса, видимо, развит сла­бо, так как они используют предпочтительно для питания уже готовые аминокислоты. У паразитов часто выявляются вторичные дефекты, связанные с паразитарным образом жизни.

Хотя у грибов и встречаются исключения экологического про­исхождения в форме сильных изменений первых этапов основного обмена, например сильное преобладание в обмене СаШагютусеэ fu. ma. go редко встречающегося типа гликолиза по пути ЭД, однако основной обмен меняется реже в зависимости от экологических условий, чем его боковые пути. Он обычно не имеет видовой или групповой специфичности, характерных для узких таксономических групп грибов, обитающих в сходных экологических условиях. Ви­довая или групповая специфичность обмена проявляется чаще всего в закрепленных филогенетически приспособлениях, развив­шихся в результате экологических воздействий в боковых ветвях метаболизма, необязательных для роста и развития, накопления биомассы и деления клеток, но необходимых для приспособления к среде обитания, как например, образование антибиотиков, ток­синов, витаминов, ферментов специального назначения, чаще всего гидролитических и других специфических ‘продуктов метаболизма.

Пути гликолиза у грибов. В настоящее время исследовано че­тыре вида путей гликолиза у грибов, являющихся первыми этапа­ми их углеродного обмена. Эти пути следующие: путь ЭМП, путь ГМФ или пентозный (апотомический) цикл, путь ЭД и глюкуро — натксилулозный (ГК). Не исключается открытие и новых путей гликолиза у грибов.

Путь ЭМП, который был изучен первым и оказался наиболее широко распространенным, характерен промежуточным метаболиз­мом через образование на первом этапе фруктозо-1,6-дифосфата (рис. 3.1). На втором и параллельном ему третьем этапах проис­ходит дальнейшая трансформация триоз, полученных после дей­ствия альдолазы.

Пировиноградная кислота — конечный продукт процесса глико­лиза — включается далее в метаболизм цикла ТКК. Однако еще не доходя до цикла ТКК, у многих грибов пировиноградная кис­лота может восстанавливаться при помощи НАДНг-дегидрогеназы до молочной кислоты. Это превращение носит название молочно­кислого брожения.

Четвертый этап составляет превращение пировиноградной кис­лоты при действии декарбоксилазы с кофактором тиаминпирофос — фатом (ТПФ) в ацетальдегид и далее при действии НАДН2-дегид — рогеназы в этиловый спирт и носит название спиртового брожения.

СОН НСОН НОСИ, НСОН НСОН СН20Р03Н2 Глю ко зо­б-фосфат

(2)

(АТФ, Мд2+)

(4)

С Н20Н

1,

(надн2)

► 2. СНОН 3. СН20Н Глицерин СООН НСОН

—

С6)

и. ип———————— ■’•т. ип————————— —————————- гтп1,ип СН,0Р03Н2 (АТФ, Мд2; СН,0Р03Н2 (АД<Р’М9 ‘ СН,0Р03Н. 2 3 2 НАД^п2*) 2 3 2 2 ‘

‘2й 3 2 3-фосфогли- цериноВая кислота

1. СН20Р03Н2- 2. С=0 , ‘з. сн2он. Диоксиацетон — I фосфат I ч4. СОН 5. НСОН

Глицеральдегид■ 3-фосфат

&сн2он а.-Шицерофосфат СООРО, Н, ►. НСОН ■

"2игиЗП2 1,3-дифосфо- глицериноВая кислота

Ч<СН_0Р03Н,

2.СН0Н

6.

1. СН20Р03Н 2. С=0 3. нос н £2 4. НСОН (1п2*) 5. НСОН

СН20Р03Н2

1. НСОРО? Н. 2. НСОН 3. носн. 4. НСОН I 5. 6. Глюкоза- 1-фосфат

3 2

(1)

(АТФ, Щ2*)

НСОН СН20Н

Рруктозо- 1,6-дифосфат

С 7)

МКБ

I СООН снон-*- СН3 Мило иная кислота

(9)

(АМф,, Щ2*)

(НАД Н2,2п2+)

3;4 СООН — 2; 5 С=0 *—- 1; 6 СН3 ПироВиноградна? кислота (ТПФ)|(10)

Л)

(НАДН2,гп2+)

1; 6 СН3 ‘ 2; 5 СОН

Ацеталь- дегид

сн3 сн2он ЗтилоВый спирт |

СД

СОН НСОН СН20Н Глицераль­дегид

СН3 I 3 + СОН ■

неон I Ацеталь — СН20Н дегид Деэокси- рибоза

сон сн2 I 2 >нсон

СООН СН0Р0,Н.

‘3‘ ‘2 СН20Н 2-фосфогли- цериноВая кислота

	I СООН — СОРО, Н,“- II 5 2 сн2 2-фосфознол- пируВат
(8)
ТКК<

СБ

Рис. 3.1. Метаболизм глюкозы через путь ЭМП. Участвующие в цикле ЭМП энзимы: / — гексокиназа; 2 — фосфоглюкокина — за и глюкозофосфатизомераза; 3 — альдолза; 4 — диоксиацетонфосфатдегидрогеназа; 5 — глицерофосфатаза; 6 — глице — ральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; 7 — фосфоглицераткиназа; 8 — э:толаза (фосфоэнолпируватгидратаза); 9 — козимаза; 10 — декарбоксилаза; II — козимаза. Кофакторы энзимов показаны п местах их действия. Распределение атомов углерода

глюкозы обозначено порядковыми номерами

Пятая трансформация в пределах пути ЭМП — это образование путем конденсации ацетальдегида и глицеральдегида сахарного ■компонента ДНК — дезоксирибозы, очень необходимой для основ­ного обмена нуклеиновых кислот.

Путь гликолиза через ГМФ, или пентозный цикл, осуществля­ется через образование из глюкозы на первом этапе глюконолак — тона и из него .глюконовой кислоты (рис. 3.2).

СР

ГКБ

У**, СОН

3. сн2он 4. С=0 — 5. НСОН 6. CH20P0jH2 Зритрулозо- Ч-фосфат

у г НСОН CH20P0jH,

(ТПЧ>)

II гг*-»

СС

с=о | неон §>« неон Ь & і § Й НСОН в ^ I І* неон СН20Р0,Н

сн, он

3 2

сон сн. он •а ‘2 *§ Qj І? а л >5§

(2)

(3)

И/

4- Н<Г0Н (АТ4>, Мд2+) ’ Н(;0Н (ФАД. Бн/ Н(;0Н (НАДДПФ)" 4’Н(?0Н С илли илли иллі I г — МАЛИ

5. НС0Н 6. CH20P0jH2 РиЗулозо- 5-фосфат

сн2он

5. НСОН I ‘6. Глюкозо- Л-фосфат

1. HC0P0jH2 2. НСОН 3. НОСН

НСОН CH20P0jH Глюкозо­б-фосфат

СОН неон HOCH

НСОН СН20Р05Н2 В-фосфо- глюконат

соон неон HOCH I

2. СН. ОН I 2 3. с=о I

СОН неон "неон неон СН20Р03Н2 РиЗозо- 5-фосфат

(5

Рис. 3.2. Метаболизм глюкозы через путь ГМФ, или пеитозный цикл. Участвую­щие в пути ГМФ энзимы: 1 — гексокииаза; 2 — глюкозофосфатоксидоредукта — за; 3 — фосфоглюкоиатдегидрогеиаза и декарбоксилаза; 4 — рибулозо-5-фосфа — тизомераза; 5 — рибулозо-5-фосфатдекарбоксилаза; 6 — эритрулозо-4-фосфат — декарбоксилаза; 7 — траискетолаза; 8 — траисальдолаза или траискетолаза.

Распределение атомов углерода глюкозы обозначено порядковыми номерами

Второй этап пентозного цикла состоит в трансформации рибу — .лозо-5-фосфата по двум альтернативным путям (рис. 3.2). Фер­мент траискетолаза, способный переносить с одного сахара на другой двухфрагментные группы углеродных соединений, содер­жащие кетогруппу, очень типичен для пути ГМФ.

Третий этап пентозного цикла состоит в конденсации с помощью трансальдолазы эритрулозо-4-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата
в сахар седогептулозу, функционирующую как резервный источник для образования серии сахаров с различным числом атомов угле­рода. Седогептулоза может образовываться также путем переноса двууглеродного фрагмента транскетолазой на пентозу. Возможны и другие перекомбинации, осуществляемые транскетолазой и транс — альдолазой.

Цикл метаболизма по пути ГМФ распространен почти так же широко, как и цикл ЭМП, и имеет весьма разнообразное назначе­ние, поскольку: 1) он необходим для образования рибозы, а сле­довательно, для синтеза РНК, 2) с его помощью создаются запасы разнообразных сахаров, пригодных для дальнейших перестроек (седогептулоза) и синтезов, 3) он обеспечивает материалом био­синтезы ароматических аминокислот из эритрозо-4-фосфата.

Путь метаболизма глюкозы по Энтнер — Дудорову был обнару­жен в связи с выявлением видов грибов, совершенно лишенных фосфогексокиназы, фермента фосфорилирующего гексозы. Calda — riomyces fumago и прорастающие споры головни Tilletia caries

1. сон	1. СООН |	1. СООН	1. СООН
1 2. НСОН	2. НСОН	j 2. НСОН	to -ri­ ll О
1 3. HOCH (1)	| 3. НОСН (2)	j 3. HOCH (3)	3. СНа
1 —*	1 (АТФ) ‘	1 —*■	1
4. НСОН	4. НСОН	4. НСОН I	4. НСОН
1 5. НСОН	| 5. НСОН	5. НСОН	j 5. СОН
j 6. СН2ОН	j 6. CHjOH	6. СН20Р03Н2	j 6. СН2ОР(ОН)3
Глюкоза	Глюконовая	6-фосфоглюконат	2-кето-З-дезокси-6-
	кислота		фосфо-D — глюконат
		(4) 1
		1
	4. СОН	1. СООН
Q4)02-<	| !————- 5. НСОН	to -ri­ ll 0 1	■С(,)02
	| 6. СН20Р03Н2	3. CH»
	Г лицеральдегид-	Пируват

З-фосфат Рис. 3.3. Метаболизм глюкозы через путь ЭД и распределение в его продуктах атомов углерода этого моносахарида (обозначены порядковыми номерами). Уча­ствующие в пути ЭД энзими: 1 — глюкозооксидаза; 2 — глюконаткиназа; 3 — б-фосфоглюконатдегидрогеназа; 4 — 2-кето-З-дезоксиглюконатальдолаза (В1и- тепіаі, 1965)

оказались способными окислять нефосфорилированную глюкозу в глюконовую кислоту с помощью глюкозооксидазы и фосфорили — ровать уже глюконат при действии глюконаткиназы (рис. 3.3). Конечные продукты цикла ЭД могут далее включаться в циклы

ЭМП и ГМФ, а также в цикл трикарбоновых кислот. Этот путь метаболизма углеводов встречается у грибов сравнительно редко.

Глюкуронат-ксилулозный путь метаболизма углеводов заклю­чается в окислении глюкозы в глюкуроновую и далее гулоновую кислоту, дающую затем начало аскорбиновой кислоте (рис. 3.4). Э-рибулозо-б-фосфат может включаться в цикл ГМФ.

1.

4. 5. 6.

2.

3. HOCH

4. 5.

Ксилитол

СОН

2. НСОН

!

3. HOCH (/>

I —

4. НСОН

5. НСОН

I

6. СН2ОН Глюкоза

1. СОН

I

2. НСОН

3. HOCH (2)

I———- *

4. НСОН

I

5. НСОН

I

6. СООН

D-глюкуроновая

кислота

1. СН2ОН

2. НСОН—С(6)02

I

3. HOCH (3)

(ТПФ)

НСОН

ніон

I

COOH

L-гулоновая

кислота

СН, ОН

I

НСОН

I

НСОН

I

СН2ОН

SHAPE \* MERGEFORMAT

1.	СН2ОН г	1.	СН2ОН і	1. СН2ОН~
2.	1 с=о	2.	1 с=о	1 2. С=0
3.	НСОН (б)	3.	1 HOCH, (5)	1 3. HOCH
4.	1 НСОН	4.	1 * (АТф) НСОН	1 4. НСОН
5.	1 СН2ОР(ОН)2	5.	1 СН2ОР (ОН)2	1 5. СН2ОН
Рибулозо-5-фосфат	О-ксилулозо-5-фос-	D-ксилулоза

4 Аскорбиновая кислота

фат

Рис. 3.4. Метаболизм глюкозы через глюкуроиат-ксилулозный путь и распреде­ление в продуктах метаболизма ее атомов углерода (обозначены порядковым® номерами). Участвующие в пути ГК эизимы: / — глюкозодегидрогеназа; 2 — глюкуронатредуктаза; 3 — гулонатдекарбоксилаза; 4 — ксилитолдегидрогеназа; 5 — фосфокиназа; 6 — изомераза (В1ите1Йа1, 1965)

(4)

Этот путь метаболизма имеется у Aspergillus niger, так как добавление в его культуру глюкуронолактона вызывает у него увеличение количества аскорбиновой кислоты втрое, выход кото­рой составляет 2,6%. Рост мицелия при этом увеличивается всего на 18% (Sastry, Sarme, 1957). Количественное значение этого пути метаболизма пока еще не изучено и, вероятно, он является «ми­норным», поскольку объем его невелик. Тем не менее значение его в обмене важно как ведущего к образованию аскорбиновой кисло­ты. Кроме A. niger он, видимо, функционирует также у Pйnicillium chrysogenum и у дрожжей.

Описанные здесь четыре типа гликолитических процессов, ве­роятно, еще не исчерпывают всего разнообразия первых этапов

углеродного метаболизма грибов. Например, известен в настоящее время путь окисления галактозы в галактуроновую кислоту, далее трансформирующуюся в галактодиальдозу. Такой путь окисления был обнаружен у дереворазрушающего базидиомицета РоІурогиБ сігсіпаіиз (Віитеггіаі, 1965). Вероятно, его обнаружения следует ожидать и у других видов.

2-кетоглюконат- киназа

Между отдельными путями гликолиза имеется связь, позволяю­щая обойти через включение альтернативных путей обмена затруд­нения из-за дефицита какого-либо энзима. Например, дефицит включающейся в обычный путь ЭМП гексокиназы у СаЫагютусеэ fumago компенсируется возможностью исходить из образующегося без фосфорилирования глюкозы 6-фосфоглюконата или 2-кето-6- фосфоглюконата с последующим включением продуктов обмена в путь ЭМП или ГМФ (рис. 3.5).

		2-кетоглюконат
Гексо-	Глюконат-	редуктаза
киназа	киназа

Глюкозооксидаза или Глюконатдегидро- глюкозодегидрогеназа геназа

Глюкоза—————————— НГлюконат 2-кетоглюконат

Глюкозо-__________________ 6-фосфат — __________________

6 фосфат гЛЮКОЗо-б-фосфатде — глю^онат 2-кето-6-фосфоглю — нат гидрогеназа конатредуктаза

^ 4

Путь ____________________ Путь_ ГМФ и/или

ЭМП ~*"путь ЭД

Рис. 3.5. Взаимосвязь различных путей метаболизма гексоз и гексоновых кис­лот у грибов (В1ите1Йа1, 1965)

Количественное соотношение разных путей гликолитического обмена у различных грибов отличается друг от друга, но большей частью у них преобладает путь ЭМП. Путь ГМФ известен как ведущий, или равноценный пути ЭМП, у немногих видов, например Pйnicillium charlesii, P. urticae, Usiilago maydis, Tilletia contra — uersa и y ряда актиномицетов.

Путь ЭД известен пока только у двух видов: С. fumago и

T. caries. Однако возможно, что впечатление о преобладании в гли — колитическом обмене пути ЭМП является результатом краткосроч­ных опытов или других условий культивирования, так как есть сведения, что путь ГМФ развивается позднее, чем путь ЭМП, в процессе дифференцировки вегетативного мицелия.

Преобладание тех или иных путей гликолиза может очень силь­но зависеть от композиции питательной среды и степени доступ­ности необходимых для гриба энергодающих систем, минеральных компонентов, микроэлементов или витаминов. В частности, это, видимо, сильно связано с относительными концентрациями серы и фосфора в среде. Поскольку путь ЭМП основан на образовании

67

•3*
двукратно фосфорилируемых соединений, как глюкозо-1,6-дифосфат и фруктозо-1,6-дифосфат, для него требуется более интенсивное снабжение фосфатом. Напротив, для пути ГМФ, по которому фос- форилирование протекает только однократно при образовании глюкозо-6-фосфата, фосфора требуется меньше, но зато необходи­мо повышенное снабжение сульфатом ввиду участия в нем SH-групп и тиамина.

Из работы Дмитриевой (1967) на примере Pйnicillium chryso — genum следует, что сдвиг баланса Р : S в пользу фосфора приводит к замедлению развития миделия, видимо, сопровождаемому пре­обладанием пути ЭМП, а сдвиг его в пользу серы — к ускорению развития с очевидным преобладанием в гликолитическом обмене пути ГМФ. Косвенными гистохимическими доказательствами на­личия метаболизма по пути ЭМП при избытке фосфора в среде являются большое накопление в клетках мицелия P. chrysogenum волютина, состоящего из полифосфатов, и стимуляция синтеза ДНК, выражающаяся в учащении деления ядер. Усиление обмена ДНК объясняется синтезом по пути ЭМП дезоксирибозы, которая является одним из факторов, лимитирующих биосинтез этой нук­леиновой кислоты, а накопление полифосфатов сигнализирует а высоком уровне фосфорилирования и расхода фосфорной кислоты в обмене (рис. 3.6).

Подтверждением преимущественного метаболизма по пути ГМФ[3] при избытке серы в среде является преобладание в мицелии про­дуцента пенициллина волютина, состоящего из РНК, что связано с усилением синтеза рибозы, одного из важнейших факторов, ре­гулирующих биосинтез рибонуклеиновой кислоты. Это совпадает с одновременной значительно большей продукцией серосодержа­щего антибиотика P. chrysogenum — трипептида пенициллина, включающего в состав молекулы цистеин. В условиях нормального оптимального баланса Р : S состояния мицелия, характерные для преобладания фосфора в среде и для сдвига баланса в пользу серы, последовательно сменяют друг друга в онтогенезе, что ука­зывает на связь пути ГМФ (по мнению биохимиков, филогенети­чески более позднего) с возрастной дифференциацией и развитием экологических приспособлений в форме продукции антибиотика.

Сходные явления наблюдались и у актиномицетов, продуцентов тетрациклинов, например у Streptomyces rimosus. Низкая продук­тивность сопровождалась у него угнетением цикла ГМФ, выра­жающимся в падении активности фосфоглюконатдегидрогеназы, и усилением пути обмена по ЭМП, о чем можно было судить по усилению активности его энзимов и по накоплению пирувата в среде.

Энергетическое значение путей гликолиза относительно неве­лико. Общее их назначение состоит в основном в подаче метабо­литов для дальнейших биосинтезов, необходимых для нормального обмена. Вещества эти могут быть следующими: 1) составляющие фрагменты, необходимые для синтеза клеточных оболочек: глю — козамин-6-фосфат или УДФАГ для биосинтеза хитина, УДФ-глю-

S>P

и актибные штаммы

Обмен

P>S и неактибные штаммы

Глюкоза АТФ-

АДФ Глюкоза 6Р

ФАД I +5H(S) "Н2

Морфо­

генетический

эффект

Волютин ПФ —»

[ РНК

ПФ

Глюкоза 1,6 РР

Фруктозо 1,6 РР

69 глюконат ТПФ(і) — С02

Рибу лозо SP ТПФ($ )|

К

Морфо —

генетический

Эффект

Гпицеральдегид ЗР

Лируват І — м2 1 T/1<P(S)

Ацетальдегид

ДНК

Дезокси рибоза

ИнтенсиЬное деление -*■ ядер

Рибозо S?

Эритрулозо і 4P * Tfl<P(S) РНК

І Л. ШЖІЖ Возрастные (разы

Волютин РНК

Рост,

торможение деления ядер 6 телофазе

Торможение развития Ф І-tu (непродуктивных) фазах. Мало антибиотика быстрый переход 6 IV — VI (продук­тивные) фазы и длительное пребывание в этом состоянии. Много антибиотика

Рис. 3.6. Свизь морфогенеза, гликолитического обмена и активности пеиицилииа в погруженной культуре Pйnicillium chrysogenutn с преобладанием фосфора

или серы в среде

коза для биосинтеза глюканов, гликогена и клетчатки, манноза при синтезе маннана, сахара, участвующие в первых этапах гли­колиза; 2) пентозы, необходимые для синтеза нуклеиновых кислот: дезоксирибоза для биосинтеза ДНК, образующаяся по пути ЭМП, рибоза для биосинтеза РНК, образующаяся по пути ГМФ; 3) за­пасные вещества для эндогенного получения энергии: УДФ-глю — коза, гликоген, жиры, глицерин и ацетальдегид; 4) метаболиты

для синтезов в пределах цикла трикарбоновых кислот: ацетальде — гид и пируват — источники для биосинтеза аминокислот и белка; 5) метаболиты для синтеза ароматических аминокислот: эритру — лезо-4-фосфат, синтезирующийся по пути ГМФ; 6) метаболиты для биосинтеза терпенов, жиров и ароматических соединений, не со­держащих азота, и т. д., такие как пируват, адетальдегид и неко­торые вещества, образующиеся по пути ГМФ.

Гликолитические пути метаболизма слабо функционируют как источники энергии, так как выход энергии в них в 20—30 раз ниже, чем в дыхательной цепи, связанной с циклом Кребса. Они играют в основном конструктивную роль в обмене веществ, поставляя раз­нообразные низкомолекулярные фрагменты для обеспечения раз­личных более сложных синтезов в процессе роста и развития жи­вых организмов, в том числе и для многочисленных боковых путей обмена, лежащих в основе их приспособлений к среде обитания.

Цикл ди — и трикарбоновых кислот Кребса. Необходимость этапа основного обмена через цикл Кребса обусловлена тем, что он дает основной материал для синтеза протеина, нуклеиновых кислот (пу­ринов и пиримидинов) и различных кофакторов ферментов белков, т. е. витаминов. Реакции цикла Кребса широко распространены среди грибов. Они установлены у 51 вида из всех основных классов грибов (Ы1ебегргиет, 1965), но интенсивность его функционирова­ния различна у разных представителей этого царства. Также, ви­димо, не у всех форм грибов представлены все реакции цикла ТКК.

Была сделана попытка связать распространение этого обмена с филогенией грибов. При этом обнаружилось, что среди низших грибов более примитивные одножгутйковые формы характеризу­ются гомоферментным обменом, т. е. образуют большей частью из глюкозы молочную кислоту, и имеют слабо функционирующий цикл ТКК. Исключение составляет только род АИотусеэ— выра­женный аэроб с сильно развитым циклом Кребса. Однако двужгу­тиковые оомицеты из семейств Барго^шакэ и Ьер1огшсе1а1ез тоже слабо образуют органические кислоты, формирующиеся, в цикле ТКК.

Исследование обмена по циклу Кребса у грибов проводится теми же путями, что и при изучении процесса гликолиза. Оценка по анализу ферментативных систем цикла ТКК затрудняется тем, что большинство его ферментов, в противоположность ферментам путей гликолиза, находящимся в цитоплазме, локализуется в ор­ганоидах клетки — митохондриях, легко разрушающихся при их изоляции в бесклеточных экстрактах грибов. При работе с этими ферментами потребовалась разработка специальных мягких мето­дов выделения митохондриальных фракций клеток и последующего отделения ферментов от структурных белков митохондрий, с кото­рыми они связаны, без потери их активности. Для этого было применено быстрое механическое разрушение клеток в подходящем растворителе, заключение их в раствор сахарозы, препятствующий набуханию митохондрий, удаление вредных металлов и т. д. Ды­хательные гранулы из митохондрий, активно дышащие и крася­щиеся гН-индикаторами, например янусом зеленым, были выделе­ны из Allotnyces tnacrogynus, Candida albicans, Fusarium lini, Aspergillus oryzae, Myrothecium oxysporum, Neurospora crassa и ряда других грибов (Niederpruem, 1965). У A. macrogynus и A. ory­zae были также выделены митохондрии, способные производить окислительное фосфорилирование.

Последовательность реакций цикла дикарбоновых и трикарбо — новых кислот (ТКК) или цикла Кребса помещена на схеме рис. 3.7.

В первом этапе с помощью конденсирующего энзима в моле­кулу фосфоэнолпирувата включается молекула углекислоты, в ре­зультате чего образуется оксалацетат с четырьмя атомами угле­рода.

Второй этап состоит в конденсации оксалацетата с ацетильной группой с образованием шестиуглеродной лимонной кислоты. Ко­факторами этой синтетазы являются коэнзим А, ионы К+ и Mg2+. Цитратсинтетаза была выделена из Aspergillus niger и из дрож­жей, но у A. niger она несколько отличалась от дрожжевой, так как не стимулировалась, а угнеталась ионами Mg2+.

В третьем этапе цикла ТКК происходят внутренние перестрой­ки, приводящие к преобразованию цитрата сначала в цисаконито — вую, а затем в изолимонную кислоту. Оба этих этапа полностью обратимы. В первом из них может участвовать высокомолекуляр­ная аконитгидратаза, не активируемая ионами Fe3+ и SH-rpynna — ми. Тот же процесс трансформации цитрата в цисаконитат и об­ратно и последующий из цисаконитата в изоцитрат может осущест­влять и другой низкомолекулярный фермент—аконитаза, активи­руемая ионами Fe3+ и SH-группами.

В четвертом этапе цикла Кребса изоцитрат окисляется изоцит — ратдегидрогеназой в оксалсукцинат. Кофакторами этого фермента являются НАДФ и металлы Мп2+ или Mg2+. При этом происходит первый сброс двух атомов водорода в дыхательную цепь с выхо­дом энергии.

В пятом этапе цикла ТКК происходит декарбоксилирование оксалсукцината с участием связанной с НАД, НАДФ, Мп2+ или Mg2+ изоцитратдегидрогеназы, приводящее к образованию пяти­углеродной а-кетоглутаровой кислоты. Производящий эту транс­формацию фермент был изучен у дрожжей и у Л. niger, у которого он связан с НАД и более лабилен в отношении температуры. Фер­менты этого этапа тесно связаны с митохондриями и требуют для поддержания их активности присутствия АТФ или ортофосфата. Образующийся в этом этапе а-кетоглутарат при его аминировании дает начало образованию глутаминовой кислоты, включающейся далее в синтез белков. Однако при недостатке восстановленных форм азота а-кетоглутаровая кислота метаболизируется далее.

Шестой этап трансформации метаболитов цикла ТКК состоит в декарбоксилировании а-кетоглутарата и одновременной конден­сации образовавшегося сукцината с коэнзимом А. Эта реакция осуществляется с помощью а-кетоглутаратдегидрогеназы, произ­водящей окислительное декарбоксилирование при участии в каче-

I УглеВоды~~ ♦ Гликолиз СООН Фоссроэнол — С0Р(0Н)2 пируВат

[ЛипиЬы | ‘

X Пальмитинобая кислота f ООН Малонил КоА СНCOS КОА

,ь„ . К, Мр(^ш*, (Н2 Оксал — (цпгу1нешт ацетат у л njger)

Жирные кислоты

I Протеин

Аспартат

Биотин)

C0DH……. ^ноГчсин ^Нг Напат СООН 2Н /(-SH анионы, ‘ингибитор гаш9ы) ^ООН "Н Фумарат ;н? н CDOH^T. iV

CHjCOSKM Ацетил КОА (2)

А ‘ f (J00H

тат

СООН

(Релиза)

(НАД, ТПФ, а-лилдаот

CH3COS/OM Ацетил КоА

SH) Ш — И» ч~Гнсоон

ШУ ингибитор СООН малонат} СН г Сукцинат снг C00HV

2Н

Сити-

глутарат fco Ьоон

Оксапсукцйнат (АТФ, НАД,

Глутамат Т | Протеин ]

Глиоксилат снгон СООН Глинокол [ Протеин |

f00H^’ сн2

(В)

Q00H РНг „ f(0H)C00H Цит-Wi ппт С ООН (л $т ■ fHj . ссоон Акони-l н

Рис. 3.7. Цикл Кребса (модификация, составлениаи по даииым №е(1егргиет, 1965). В скобках приведены кофакторы и стимуляторы активности данного эн­зима. Участвующие в цикле Кребса эизимы: 1 — пируваткарбоксилаза; 2 — цитратсиитетаза; 3 — акоиитаза; За — акоиитгидратаза; 4— изоцитратдегидро — геиаза; 5 — изоцитратдекарбоксилаза; 5а — изоцитратаза; 6 — а-кетоглутарат — дегидрогеиаза; 7 — сукцииатдегидрогеназа; 8 — фумараза; 9 — малатдегидро-

геиаза

стве кофакторов А^2+, 2п2+, ТПФ, НАД, а-липоевой кислоты и КоА, содержащего БН-группу. При этом происходит освобождение энергии, сопровождающее второй сброс в дыхательную цепь двух атомов водорода и образование четырехуглеродного метаболита

(сукцината) в цикле ТКК. Поскольку производящий эту реакцию фермент имеет в своем составе КоА и, следовательно, SH-группы, при утрате им активности под влиянием арсеиита она может быть возвращена при действии тиоловых соединений. Ферменты этого этапа также содержатся в митохондриях и были получены из ми­целия A. niger (Ramakrishnan, 1954, цит. по Niederpruem, 1965).

В следующем, седьмом, этапе цикла ТКК сукцинил коэнзим А трансформируется в сукцииат и с помощью сукцииатдегидрогеназы, содержащей в качестве кофакторов флавииовый нуклеотид, 4 мо­лекулы негемового Fe3+ на молекулу энзима и SH-группы, транс­формируется в фумаровую кислоту. При этом происходит третий сброс двух атомов водорода в дыхательную цепь и третий случай освобождения энергии в процессе прохождения этого цикла. Сук — цинатдегидрогеназа была получена в виде препарата 65% чистоты из дрожжей, а также была выделена из ряда гифообразующих грибов таких, как Aspergillus niger, Neurospora crassa, Myrotheci — um verrucaria, Penicillium chrysogenum и Claviceps purpurea. Эн­зим из С. purpurea оказался сходным с соответствующим энзимом млекопитающих по оптимальной активности при pH 7,7 и конку­рентному подавлению его фумаратом, пирофосфатом и малонатом. Однако в противоположность энзиму из млекопитающих, эизим из Claviceps мало реагировал на действие фосфата.

Восьмой этап цикла Кребса состоит в гидрировании фумаровой кислоты с помощью фумаразы и в превращении ее в яблочную кислоту (малат). Фермент фумараза стимулируется двух — и трех — валеитными анионами и SH-группами, ио подавляется одновалент­ными анионами, такими как галоиды и CNS. Этот фермент был выделен из A. niger и из ряда дрожжей. У дрожжей Candida utilis он существует в двух формах с разным оптимальным pH для их активности. Обе формы удалось разделить с помощью электро­фореза.

Последний, девятый, этап цикла ТКК состоит в окислении ма — лата в оксалацетат, что осуществляется с помощью фермента ма- латдегидрогеиазы, которая относится к дегидрогеназам а-гидрок — сикарбоксиловых кислот и имеет в качестве кофактора НАД. Эта дегидрогеназа была получена в виде сто — двестикратно очищенного препарата из супернатанта гомогената клеток дрожжей, т. е., ви­димо, ие связана с митохондриями. У Neurospora crassa были най­дены четыре изозима этого фермента (Niederpruem, 1965), а у Uго­ту ces phaseoli (U. appendiculatus) найдено три таких изозима в его уредоспорах. В этом этапе происходит последний, если ие считать момента включения С02 в пируват, четвертый, сброс двух атомов водорода в дыхательную цепь.

Цикл глиоксилата, являющийся укороченным вариантом цикла ТКК, обнаруженным первоначально у бактерий, встречается также и у грибов, как у дрожжевых, так и у гифообразующих. Этапы обмена по глиоксилатиому пути состоят в следующем (см. рис. 3.7).

Под влиянием фермента изоцитратазы, при одновременном участии коэизима А, происходит расщепление изолимонной кисло­ты на сукдинил — КоА и глиоксилевую кислоту, содержащую соче­тание карбоксильной и спиртовой групп, удобное для процессов конденсации. Сукцинил-КоА трансформируется далее по ходу цик­ла ТКК в сукцинат и фумарат, а глиоксилат конденсируется с по­мощью фермента малатсинтетазы с ацетил-КоА, что приводит к образованию яблочной кислоты. При этом отпадает необходимость в прохождении трех этапов цикла ТКК от изоцитрата до сукци — нил-КоА и источник для образования аспарагиновой кислоты в форме малата пополняется сразу двумя путями: через путь сук­цинат— фумарат—малат и через конденсацию глиоксилата с аце — тил-КоА. Кроме того, возможен третий путь через восстановление оксалацетата.

Все это приводит к быстрому накоплению обильного материала для биосинтеза аспарагиновой кислоты, получающейся путем ами — нирования малата или оксалацетата и вовлекающейся далее в био­синтез белков. Значение метаболизма в пределах цикла Кребса для грибов так же, как и в случае других живых организмов, сво­дится к трем основным функциям.

1. Синтез «материнских», или первичных, аминокислот путем аминирования кето — и оксикислот, на основе которых далее синте­зируются белки. Главнейшие из этих путей аминирования состоят в трансформациях: оксалацетат (или малат)-аспарагиновая кис­лота, а-кетоглутарат — глутаминовая кислота и, на пороге цикла ТКК и гликолиза, пируват—аланин, а также глиоксилат—глицин.

2. Получение энергии и реализация окислительного фосфори — лирования в дыхательной цепи, т. е. процесса запасания энергии. Эта функция выполняется благодаря пятикратному сбрасыванию 2Н+ в процессе окисления кислот цикла Кребса. Запас энергии накапливается при этом в форме АТФ или других макроэрги — ческих соединений и служит источником снабжения энергией все­возможных синтезов.

3. Звено цикла ТКК, в котором осуществляется усвоение С02 при образовании щавелевоуксусной кислоты, так же, как и вклю­чение СОг в ацетат при образовании малоната (в жировом обме­не), может служить для пополнения в клетке запаса углерода, используемого в различных биосинтезах.